脊髓小腦性共濟失調(diào)3型的臨床特征和基因診斷

王子峰，李連平，曲立貞，蘇 凈，李季春，曹 霞*

(1濟寧醫(yī)學院附屬高唐縣人民醫(yī)院，山東高唐252800;2濟南軍區(qū)總醫(yī)院)

脊髓小腦性共濟失調(diào)是一種以肢體運動協(xié)調(diào)障礙為主要特點的常染色體顯性遺傳疾病?；?qū)W檢測是目前診斷遺傳性脊髓小腦性共濟失調(diào)(SCA)的金標準。近1年來，本研究對其臨床特征及基因診斷方面的特征進行了探討。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集臨床診斷為SCA家系20例，均為漢族，其中患者10例、家系內(nèi)正常人10例。家系1:先證者(Ⅲ6)，男，38歲。該家系來自山東地區(qū)，家族無近親結婚史。4代17例成員中女性患者2例，男性患者4例，發(fā)病年齡25～36歲，符合常染色體顯性遺傳規(guī)律。先證者體征:構音不清，偶有飲水嗆咳，向右注視時可見慢眼動，向左注視時可見快速眼震。雙上肢近端肌肉、雙側胸鎖乳突肌明顯萎縮，雙上肢肌力Ⅴ級，雙下肢肌力Ⅳ級?？梢娂∪馐?。四肢肌張力增高。指鼻試驗、雙手輪替運動均不穩(wěn)準，右側重于左側。雙上肢肱二頭肌反射、肱三頭肌反射均活躍，雙下肢膝腱反射、跟腱反射均亢進。髕陣攣、踝陣攣均陽性。雙側Hoffmans征陽性，雙側Babinski’s征陽性，余病理征未引出。腦膜刺激征陰性。家系內(nèi)其他部分患者可見眼球內(nèi)陷、雙側快速眼震等體征。家系2:先證者(Ⅲ6)，女46歲，該家系來自山東地區(qū)，患者母親、舅舅、1個弟弟均有類似癥狀，4代14例成員中女性患者2例，男性患者2例，最高發(fā)病年齡52歲，最低發(fā)病年齡42歲，平均發(fā)病年齡46歲，符合常染色體顯性遺傳規(guī)律。先證者體征:神志清楚，言語清晰，顱神經(jīng)檢查未發(fā)現(xiàn)異常，四肢肌力Ⅴ級，肌張力正常，閉目難立征(+)，T6以下痛覺減退，雙下肢末端觸覺減退，雙側膝關節(jié)以下振動覺減退，雙側腱反射對稱減弱，病理征未引出，頸軟，腦膜刺激征陰性。家系1遺傳家系圖:見圖1(使用中國遺傳咨詢網(wǎng)家系圖在線繪制工具繪制)。家系2遺傳家系圖:見圖2(使用中國遺傳咨詢網(wǎng)家系圖在線繪制工具繪制)。

圖1 家系1遺傳家系圖

圖2 家系2遺傳家系圖

1.2 實驗方法

1.2.1 PCR反應 使用TaKaRa DNA提取試劑盒(大連寶生物工程有限公司提供)提取患者靜脈血中DNA。SCA3亞型引物的PCR參照文獻。2%瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下觀察PCR擴增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)2個家系SCA3引物PCR擴增均發(fā)現(xiàn)異常條帶，考慮為 SCA3亞型。使用 TaKaRa Agarose Gel DNA Purifiation Kit Ver.2.0瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(大連寶生物工程有限公司提供)回收DNA。

1.2.2 PCR產(chǎn)物克隆及測序 家系1先證者SCA3引物PCR產(chǎn)物電泳結果，可見400 bp大小異常條帶，回收此條帶DNA進行純化。將已純化PCR產(chǎn)物使用 TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2.0(Code No.D6022)中的SolutionⅠ直接和載體pMD18-T(Code No.D101A)連接，連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化至E.coli Competent Cell JM109中，涂布平板(LB液體培養(yǎng)基)，37℃過夜培養(yǎng)，觀察有無菌落。然后挑取不同白色單個菌落加入LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 h以上，以此菌液為模板，使用M13-47/RV-M(M13-47堿基序列:CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC;RV-M堿基序列:GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG)引物進行PCR擴增，電泳檢測。并同時移板(LB液體培養(yǎng)基)，挑選陽性克隆子進行基因序列測定。將選定的含有陽性克隆的單菌落進行植菌，利用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV801A)提取質(zhì)粒。在 ABI PRISM 3130XL型全自動DNA測序儀上使用RV-M引物對質(zhì)粒測序。

2 結果

2.1 部分患者瓊脂糖凝膠電泳結果 家系1先證者及家系內(nèi)其他患者，均可見一條約250 bp基因條帶和一條400 bp異?；驐l帶。因等位基因一條來自父方，一條來自母方，家系1先證者為父系遺傳，因此250 bp基因條帶來自等位基因的母系基因，400 bp異常基因條帶來自等位基因的另一條父系異?；颉＜蚁?正常人SCA3 PCR產(chǎn)物均可見約250 bp正常擴增條帶。先證者兒子PCR產(chǎn)物電泳結果，未見異常電泳條帶。家系2患者SCA3 PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳均可見約400 bp異常條帶。家系2正常人SCA3 PCR產(chǎn)物凝膠電泳擴增條帶均可見約250 bp左右正常電泳條帶，未見異?；驍U增帶。

2.2 2個家系患者發(fā)病特點及部分測序結果 見表1。

3 討論

脊髓小腦性共濟失調(diào)3型是SCA中最為常見

表1 2個家系患者發(fā)病特點及部分測序結果

2.3 2個家系部分患者SCA3 PCR擴增產(chǎn)物基因測序 見圖1、圖2、圖3。的類型，在漢族人群的脊髓小腦性共濟失調(diào)中約占50%。SCA3的臨床表型具有高度的遺傳異質(zhì)性和臨床變異性，根據(jù)目前研究，大致分為5種不同臨床亞型［2，3］，根據(jù)此種分型，家系 1 患者病情嚴重，發(fā)病年齡較早，主要表現(xiàn)為小腦體征，同時伴有嚴重的錐體系和錐體外系癥狀，部分患者可見突眼，屬于第1種亞型。家系2患者癥狀相對較輕，起病晚，伴有周圍神經(jīng)病變?yōu)槠涮攸c，屬于第3種亞型。

關于SCA3亞型發(fā)病機制，研究表明系由突變的CAG重復堿基片段編碼含有多聚谷氨酰胺片段的蛋白所致?。?］。正常人與患者的主要區(qū)別表現(xiàn)在CAG重復數(shù)目的不同，正常人CAG重復數(shù)目一般為12～41次，患者62～84次。國內(nèi)謝秋幼報道，SCA3患者CAG重復數(shù)目為67～85次。本研究中的2個SCA3家系患者CAG重復數(shù)目為51～67次，明顯低于謝秋幼等報道。且2個家系患者代間傳遞中有明顯的發(fā)病年齡提前趨勢，從表1可以看出家系1患者發(fā)病年齡第3代比第2代提前，癥狀有加重趨勢;家系2患者發(fā)病年齡第3代比第2代也明顯提前5歲左右，癥狀程度類似。家系1患者臨床癥狀在代間傳遞中有明顯的加重趨勢。在此表中還可看出，2個家系CAG重復序列數(shù)在第3代患者中比第2代明顯增多。這也提示臨床癥狀、發(fā)病年齡均與CAG重復數(shù)目有關，CAG重復次數(shù)越多發(fā)病年齡越小且癥狀越重［4］，進一步證明了此前提到的遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象。遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象主要在父系遺傳中更明顯。家系1先證者屬于父系遺傳，也說明了這一點。在家系2先證者屬于母系遺傳，家系2第3代患者中CAG重復序列數(shù)比第2代CAG序列數(shù)無明顯增多，雖發(fā)病年齡提前，但癥狀無加重，需進一步搜集病例分析母系遺傳中SCA3的表現(xiàn)。此外，家系1中Ⅲ1 CAG重復序列數(shù)為53次，Ⅲ6 CAG重復序列數(shù)為67次，但Ⅲ1患者發(fā)病年齡比Ⅲ6發(fā)病年齡提前9歲;家系2部分患者中CAG重復序列數(shù)多于家系1患者，但臨床癥狀卻較家系1患者輕，這種現(xiàn)象可能與遺傳異質(zhì)性有關。由于不同患者具有不同的遺傳基礎，從而導致遺傳方式、病程進展、發(fā)病年齡、預后以及復發(fā)風險、病情嚴重程度等都可能不同。研究表明，遺傳異質(zhì)性的存在是導致遺傳病病種增多的原因之一。

家系2中Ⅰ3、Ⅰ4生前均沒有共濟失調(diào)癥狀，死因也可排除SCA類疾病，但在子代中出現(xiàn)了發(fā)病患者。這是因為CAG重復片段所在的等位基因具有多態(tài)性的特點［5］，如果等位基因攜帶有處于正常與異常之間的CAG重復數(shù)目(即所謂帶有中間數(shù)目的CAG重復片段，國外報道SCA3一般為48～51次［6］)，由于CAG重復片段的不穩(wěn)定性，在下一代中CAG重復易發(fā)生新的突變發(fā)病，尤其在父系遺傳中更明顯。因此推測家系2的Ⅰ3(男性，75歲時去世)可能攜帶有中間數(shù)目的CAG重復片段。

SCA3癥狀前患者，是指基因檢測CAG重復數(shù)目異常，尚無臨床癥狀的人。由于SCA3是一種遲發(fā)性神經(jīng)變性疾病，因此癥狀前患者達到一定年齡必定會出現(xiàn)癥狀。在目前尚無有效治療方法的情況下，基因?qū)W檢查明確癥狀前診斷防止該病發(fā)生具有重要意義。在本實驗的家系1中，Ⅲ1屬于癥狀前患者，因為在留取血樣時，患者尚未出現(xiàn)臨床癥狀，經(jīng)基因檢測CAG重復數(shù)目為53次，在隨訪2 a后患者出現(xiàn)共濟失調(diào)癥狀，且發(fā)病年齡較其父親提前，癥狀更重。這也證實了癥狀前基因診斷預測發(fā)病的準確性。癥狀前診斷的重要意義在于使SCA家系中正常人對于自己是否發(fā)病有準確的預測，使癥狀前患者在婚育年齡對下一代做到產(chǎn)前診斷，防止帶有異?；虻幕純撼錾τ诮?jīng)基因診斷明確為SCA3或其他SCA亞型的患者，對家系內(nèi)正常人均應留取血液進行基因?qū)W檢測，篩選家系內(nèi)的癥狀前患者，一旦診斷CAG重復序列異常，即可診斷成立，其致病基因的外顯率為100%。

［1］段曉慧，顧衛(wèi)紅，王國相.常染色體顯性遺傳脊髓小腦性共濟失調(diào)表型和基因型的相關性［J］.中日友好醫(yī)院學報，2008，22:41-43.

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［4］Sakai T，Kawakami H.Machado-Joseph disease:a proposal of spastic paraplegic subtype［J］.Neurology，1996，46(3):846-847.

［5］Ikeda H，Yamaguchi M，Sugai S.Expanded polyglutamine in the Maehado-Joseph Disease protein induces cell death in vitro and in vivo［J］.Nat genet，1996，13(2):196-202.

［6］Viktor Honti，László Vécsei.Genetic and molecular aspects of spinocerebellar ataxias［J］.Neuropsychiatric Disease and Treatment，2005，1(2):125-133.