腺病毒介導(dǎo)的鳥(niǎo)氨酸脫羧酶反義RNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)侵襲的抑制作用

鄧文勝，萬(wàn)小衛(wèi)，盧 軍，孫金娥，馬 榕，劉賢錫，孫學(xué)英

(1山東省警官總醫(yī)院，濟(jì)南250002;2山東大學(xué)齊魯醫(yī)院;3山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中心;4新西蘭奧克蘭大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)系)

鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(0DC)是多胺生物合成途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶。據(jù)報(bào)道，ODC在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增高，與腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有一定關(guān)系。2007年1月～2008年4月。我們檢測(cè)了ODC基因在乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞中的表達(dá)并觀察了腺病毒介導(dǎo)的ODC反義RNA(rAd－ODC/Ex3as)對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外增殖的抑制作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌 MDA－MB－231細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱(chēng)乳腺癌細(xì)胞)和正常乳腺上皮MCF－10A細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱(chēng)正常乳腺細(xì)胞)由澳大利亞Monash大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供;羊抗人ODC多克隆抗體、鼠抗人Pan－actin單克隆抗體購(gòu)于 Sant Cruz Biotechnology;BCA試劑盒購(gòu)自碧云天公司;相關(guān)試劑分別購(gòu)自Pierce公司、BD公司。rAd－ODC/Ex3as(以下簡(jiǎn)稱(chēng)反義RNA)和rAd－綠色熒光蛋白(GFP)由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中心包裝完成。

1.2 乳腺癌細(xì)胞與正常細(xì)胞ODC蛋白表達(dá)檢測(cè)將兩種細(xì)胞株用0.15%的胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，2 700 r/min離心3min，去上清，加適量 DME/10%FBS重懸，配成5×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液，接種細(xì)胞時(shí)根據(jù)不同細(xì)胞系生長(zhǎng)速度的不同，分別接種不同的細(xì)胞數(shù)于直徑10cm的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)48 h后，觀察細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，開(kāi)始收獲細(xì)胞，采用Western Blot法檢測(cè)。

1.2 細(xì)胞干預(yù)及相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 將乳腺癌細(xì)胞及正常乳腺細(xì)胞分別用0.15%的胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，2 700 r/min×3min離心，去上清，加適量DME/10%FBS重懸，配成5×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液，接種于直徑10cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)48 h。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按5×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并24 h并分為三組，每組6個(gè)復(fù)孔。反義RNA組以50 MOI(=空斑形成單位/細(xì)胞數(shù))反義RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞;空載體組以50 MOI的Ad－GFP感染細(xì)胞;對(duì)照組不干預(yù)。處理后24、48、72、96 h 加入 0.5%MTT(5 mg/ml)，每孔 20 μl，孵育4 h再加入二甲基亞砜150 μl溶解紫藍(lán)色沉淀，觀察以下項(xiàng)目:①細(xì)胞增殖抑制率:酶標(biāo)儀測(cè)定各組570 nm波長(zhǎng)值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。抑制率=(1－實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%。②ODC蛋白表達(dá):干預(yù)后各組細(xì)胞均于DME/10%FBS的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后裂解細(xì)胞。采用Western Blot法測(cè)定ODC蛋白表達(dá)。③細(xì)胞周期:細(xì)胞干預(yù)48 h后胰酶消化，PBS洗滌，加入預(yù)冷70%乙醇1 ml，4℃固定12 h;PBS洗滌，加入4 ug RNA酶，室溫保濕30min;加入終濃度為20 μl/ml的碘化丙啶(PI)孵育30min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，計(jì)算G0－G1期細(xì)胞百分率。④細(xì)胞增殖、侵襲能力:各組均行基底膜侵襲試驗(yàn)，Transwell小室(孔徑8 μm)表面覆蓋終濃度為0.7 mg/ml的基質(zhì)膠，放入 6孔板中，下層加入 2.6 ml DME/10%FBS。細(xì)胞干預(yù)24 h后胰酶消化收集細(xì)胞，小室上層加入1.5 ml細(xì)胞懸液(濃度為5×105個(gè)/ml)。Transwell小室于37℃、5%CO2下孵育4 h，用棉簽?zāi)ㄈノ创┻^(guò)的細(xì)胞，固定小室底部的細(xì)胞并行HE染色。每孔選取5個(gè)不同的區(qū)域，于200×顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，t檢驗(yàn);P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 空載體組細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，反義RNA組細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減慢，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線更趨低平(圖2)，細(xì)胞增殖最大抑制率為60%。

2.2 ODC蛋白表達(dá) 見(jiàn)圖1。

圖1 各組ODC蛋白表達(dá)

2.3 細(xì)胞周期 干預(yù)后48 h反義RNA組細(xì)胞周期停止于G1期，G1期細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組(表1)，空載體組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組細(xì)胞周期及穿膜細(xì)胞數(shù)(n=6，±s)

表1 各組細(xì)胞周期及穿膜細(xì)胞數(shù)(n=6，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.01;與空載體組及對(duì)照組比較，△P＜0.01

組別 G0～G1細(xì)胞(%) 穿膜細(xì)胞(個(gè))空載體組 31.94 ±5.81* 40.20 ±5.86*28.56 ±3.63 45.00 ±3.45反義 RNA組 76.15±5.13＊△ 20.97±5.30＊△對(duì)照組

3 討論

多胺是一類(lèi)脂質(zhì)陽(yáng)離子，包括腐胺、精咪和精胺，鑒于其代謝、攝取和功能可作為腫瘤預(yù)防和治療的靶位［1，2］，多胺生物合成抑制劑或多胺類(lèi)似物理論上可阻斷腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移 。ODC是多胺合成的關(guān)鍵酶，可催化鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦罚?］，眾多研究表明，多胺/ODC途徑與乳腺癌有密切關(guān)系。Mimori等［4］報(bào)道，ODC過(guò)表達(dá)與較年輕女性、腫瘤體積較大及預(yù)后較差者有顯著相關(guān)性。Glikman等［5］報(bào)道，正常乳腺組織和良性乳腺疾病組織中均檢測(cè)不到ODC表達(dá)，而表達(dá)較高水平ODC的惡性乳腺腫瘤細(xì)胞則具有較高的細(xì)胞質(zhì)構(gòu)成、核間變以及較低的組織分化。Kubotas等［6］則認(rèn)為，ODC過(guò)表達(dá)不僅與乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，而且與其侵襲性有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞ODC基因表達(dá)明顯高于正常乳腺細(xì)胞，與上述研究結(jié)果相符。

反義RNA技術(shù)是一種從核酸復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上高度特異性抑制靶基因表達(dá)的方法，可選擇性、序列特異性抑制基因表達(dá)。其主要包括反義RNA技術(shù)和反義寡核苷酸技術(shù)，是目前最常用的體細(xì)胞基因治療方法之一。腺病毒載體具有體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移能力，可有效感染非分裂期細(xì)胞，并攜帶大量的基因片段;重要的是其攜帶的基因不整合到宿主細(xì)胞染色體上，可大大降低由整合而帶來(lái)的危險(xiǎn)性。腺病毒載體可有效轉(zhuǎn)染靜息期細(xì)胞，因此可將攜帶外源基因的重組腺病毒載體直接注入組織中，原位感染組織細(xì)胞;其表達(dá)時(shí)間較長(zhǎng)，通過(guò)選擇病毒的分布方式，也可將基因轉(zhuǎn)移局限在某一靶器官中。

反義RNA是一種能表達(dá)ODC第三外顯子反義RNA的重組腺病毒，本研究結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染反義RNA后ODC蛋白表達(dá)受抑，生長(zhǎng)明顯減慢，提示抑制ODC表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng);反義RNA作用后停留于G1期的細(xì)胞增多，表明其可使乳腺癌細(xì)胞周期阻滯于G1期。其機(jī)制可能為反義RNA通過(guò)p53非依賴(lài)途徑誘導(dǎo)p21過(guò)表達(dá)，從而抑制 CDK 活性，致使細(xì)胞周期阻滯［7～9］。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最顯著的特征，是一個(gè)多步驟的過(guò)程［10］，研究證實(shí)，ODC活性與間質(zhì)金屬蛋白酶2、絲裂原活化蛋白激酶活性(Erk磷酸化)有密切關(guān)系;抑制 ODC活性可能抑制 MMP－2及MAPK活性從而減慢對(duì)IV型膠原的降解，導(dǎo)致細(xì)胞侵襲能力降低［11］。本研究反義RNA組穿膜細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)低于對(duì)照組，提示下調(diào)ODC活性有可能降低癌細(xì)胞的侵襲性。

總之，ODC活性升高與乳腺癌發(fā)生及侵襲有一定關(guān)系，ODC有可能作為一個(gè)乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo);rAd－ODC能降低ODC蛋白表達(dá)從而抑制其活性，使細(xì)胞增殖停滯于G1期，并抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲。本研究為乳腺癌的基因治療研究提供了理論依據(jù)。

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