天然藥物 IHA-01篩選敏感腫瘤細(xì)胞株及其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

李秋恬，洪 敏，陳 曉，李少遊，繆延棟，耿計(jì)偉，李 臣，尹燕鷹，董 堅(jiān)

(昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，昆明650032)

IHA-01(代號(hào))是從云南傳統(tǒng)藥用植物水朝陽(yáng)旋覆花中提取、精制的天然藥物，主要含半萜類抗腫瘤活性成份。2009年8月～2010年12月，我們對(duì)IHA-01的敏感細(xì)胞株進(jìn)行了篩選，并對(duì)其誘導(dǎo)敏感細(xì)胞株凋亡的作用進(jìn)行了觀察，旨在為IHA-01作為抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 IHA-01(本課題組委托中科院昆明植物所提取，相對(duì)分子質(zhì)量為306)。細(xì)胞株:人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435，人腸癌細(xì)胞株 HCT-8、HT29、LS-174T，人肺癌細(xì)胞株 Calu-1，人肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721，人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2，人膽管癌細(xì)胞株 QBC-939，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251(均購(gòu)于上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù)，本室保存);人個(gè)舊肺癌細(xì)胞株GLC、YTLC(本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng))。FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó) B-D公司)。

1.2 敏感細(xì)胞株篩選

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù) 分別選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述12種腫瘤細(xì)胞接種于96孔板，貼壁培養(yǎng)24 h;均分為兩組。實(shí)驗(yàn)組加入IHA-01，終濃度分別為3.125、6.25、12.5、25 和 50 μg/ml，每個(gè)濃度設(shè) 5 個(gè)復(fù)孔;對(duì)照組加入等體積不含藥物的培養(yǎng)基，96孔板置于溫箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.2 觀察項(xiàng)目及判定標(biāo)準(zhǔn) CCK-8法測(cè)定各組細(xì)胞增殖抑制率:試劑作用后采用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm、650 nm處各孔吸光度值(A值)，細(xì)胞增殖抑制率=［1－(A加藥組－A空白組)/(A陰性對(duì)照組－A空白組)］×100%。用線性回歸方法計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。IC50值最低者為敏感細(xì)胞株，IC50值最高者為不敏感細(xì)胞株;細(xì)胞增殖抑制率最高的作用濃度為最佳作用濃度。

1.2.3 篩選結(jié)果 IHA-01對(duì)12株腫瘤細(xì)胞均有不同程度的抑制殺傷作用，細(xì)胞增殖抑制率隨IHA-01濃度增加而升高;最佳作用濃度為1.29 μg/ml。MDA-MB-231、MDA-MB-435、HCT-8、HT29、LS-174T、GLC、YTLC、Calu-1、SMMC-7721、CNE-2、QBC-939 和 U251的 IC50值分別為(4.81 ±1.13)、(5.07±2.73)、(1.29 ± 0.35)、(4.77 ± 0.37)、(5.12 ±1.26)、(6.09 ± 1.68)、(7.23 ± 2.57)、(5.33 ±0.82)、(7.67 ± 1.66)、(7.94 ± 1.84)、(6.09 ±1.44)和(7.4 ±0.73)μg/ml，最低及最高 IC50值分別為HCT-8及CNE-2細(xì)胞。確定HCT-8為IHA-01敏感株，CNE-2為不敏感株。

1.3 IHA-01干預(yù)敏感細(xì)胞株及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 IHA-01干預(yù)及細(xì)胞形態(tài)觀察 取1.29 μg/ml的IHA-01分別作用于HCT-8細(xì)胞及CNE-2細(xì)胞，48 h后光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2 IHA-01干預(yù)及細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT-8細(xì)胞接種于25cm2培養(yǎng)瓶中并分為兩組。實(shí)驗(yàn)組加入 IHA-01，使其終濃度為 1.29 μg/ml;對(duì)照組加入同體積PBS。藥物作用24 h后收集細(xì)胞1×106個(gè)，PBS重懸于EP管中，緩慢加入70%的冰乙醇1 ml，4℃固定1 h，采用Annexin V/7-AAD染色，結(jié)果以Annexin V標(biāo)記陽(yáng)性，7-AAD標(biāo)記陰性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3 IHA-01干預(yù)及細(xì)胞端粒酶活性檢測(cè) 取1.29、6.25、12.5、25 和 50 μg/ml濃度的 IHA-01 分別作用于HCT-8細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)，24 h后收集2×105個(gè)細(xì)胞采用PCR-ELISA法行端粒酶活性檢測(cè)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。對(duì)照組為未加入藥物HCT-8細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，酶標(biāo)儀測(cè)定450～690 nm處的光密度值(A值)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS12.0軟件包行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，采用方差分析和t檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài) IHA-01作用后HCT-8細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)由不規(guī)則形變?yōu)閳A形，胞體皺縮，貼壁能力降低，細(xì)胞質(zhì)密度增加，細(xì)胞膜完整;CNE-2細(xì)胞僅有部分失去原有形態(tài)、胞體皺縮。

2.2 細(xì)胞凋亡率 1.29 μg/ml IHA-01作用24 h后，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組 HCT-8細(xì)胞凋亡率分別為62.3%、11.3%，P ＜0.01。

2.3 細(xì)胞端粒酶活性 兩組端粒酶活性比較見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，不同濃度IHA-01均可抑制端粒酶活性，且呈濃度依賴性。

表1 不同濃度IHA-01作用24 h HCT-8細(xì)胞端粒酶活性(n=3，±s)

表1 不同濃度IHA-01作用24 h HCT-8細(xì)胞端粒酶活性(n=3，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.01;與實(shí)驗(yàn)組其他濃度比較，△P均＜0.01

組別 A值1.68 ±0.012實(shí)驗(yàn)組1.29 μg/ml 1.07 ±0.037＊△6.25 μg/ml 0.59 ±0.003*12.5 μg/ml 0.30 ±0.038*25 μg/ml 0.29 ±0.01*50 μg/ml 0.27 ±0.021*對(duì)照組

3 討論

從天然植物中開(kāi)發(fā)生物活性成分，尋找高效低毒的抗癌新藥一直是研究的熱點(diǎn)。天然植物產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)獨(dú)特，生物活性廣泛，不易耐藥等優(yōu)點(diǎn)［1］，是抗癌活性成分的重要來(lái)源。目前臨床上常用的抗癌藥物，如抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的喜樹(shù)堿、以抗微管蛋白活性為靶點(diǎn)的紫杉醇和長(zhǎng)春新堿等均為從植物中分離篩選、結(jié)構(gòu)改造及化學(xué)合成的。IHA-01是從天然植物水朝陽(yáng)旋覆花中提取、精制而成。水朝陽(yáng)旋覆花為菊科植物旋覆花屬，為多年生草本植物，載于《滇南本草》［2］，主治乳巖、乳癰、紅腫疼痛、暴赤火眼、目疾疼痛、祛風(fēng)明目、隱澀羞明伯日，傷風(fēng)寒熱咳嗽。

近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與細(xì)胞程序性死亡有關(guān)，部分源自天然植物的化療藥和細(xì)胞毒制劑是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡而起治療作用的［3～5］;化療藥物抗腫瘤治療的部分機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)［6］。本研究結(jié)果顯示，IHA-01對(duì)12種腫瘤細(xì)胞均有誘導(dǎo)凋亡的作用，尤其是對(duì)HCT-8細(xì)胞。關(guān)于藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，有學(xué)者認(rèn)為與Caspase-9、Caspase-3蛋白酶激活及Survivin蛋白表達(dá)下降有關(guān)［7］，也有學(xué)者認(rèn)為與抑制NF-κB的活性有關(guān)［8］。本研究未作上述相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，有待下一步研究。

端粒酶是一種維持染色體結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定的核糖核蛋白，其激活與癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲及腫瘤惡性程度關(guān)系密切［9］。研究表明紫杉醇和拓?fù)涮婵档戎参镱惪鼓[瘤藥物的抗瘤作用與影響端粒酶活性有關(guān)［10，11］，故抑制端粒酶活性可能成為腫瘤治療的新策略［12～14］。有文獻(xiàn)報(bào)道端粒酶與細(xì)胞凋亡有一定的相關(guān)性，端粒酶活性高者細(xì)胞凋亡少，反之則凋亡增加［15］。研究證實(shí)，植物來(lái)源的化療藥物喜樹(shù)堿在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時(shí)，端粒酶活性亦相應(yīng)下降［16］。本研究結(jié)果顯示，IHA-01可明顯降低HCT-8細(xì)胞的端粒酶活性，且與藥物濃度呈正相關(guān)。

綜上所述，HCT-8細(xì)胞為IHA-01的敏感細(xì)胞株。IHA-01可明顯抑制HCT-8增殖，其機(jī)制可能為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、降低腫瘤細(xì)胞端粒酶活性。本研究為IHA-01的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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