七氟醚預(yù)處理大鼠腎缺血再灌注損傷中NF－κB 表達、NOS活性變化及意義

顧福萍，何煥鐘，顧棟樺，徐伯贏，沈 洪

(1浙江湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江湖州313000;2湖州市中心醫(yī)院)

腎缺血再灌注是臨床中常見的致?lián)p傷過程，存在于失血、脫水、感染等原因所致休克、血管梗阻、腎移植等過程中，可導(dǎo)致急性腎損傷。NF－κB作為一種廣泛存在的誘導(dǎo)性核轉(zhuǎn)錄因子，其在缺血再灌注損傷中的作用是近年來缺血再灌注損傷機制研究的重要進展［1］?；罨?NF－κB可啟動和調(diào)節(jié)眾多與免疫和炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞因子及粘附分子等炎性介質(zhì)的基因表達;而抑制NF－κB的表達，則可降低炎性介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，對再灌注損傷的組織產(chǎn)生保護作用［2］。七氟醚是一種吸入麻醉藥，已證實其對缺血再灌注心、腦、腎均有較好的保護作用［3～5］。2010年6月，我們觀察了七氟醚預(yù)處理對腎缺血再灌注大鼠腎組織NF－κB表達和一氧化氮合酶(NOS)活性的影響，旨在探討七氟醚對腎缺血再灌注損傷的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 成年健康SD雄性大鼠72只，體質(zhì)量(200±20)g，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院;肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、NOS試劑盒均購自江蘇南京建成生物工程研究所;NF－κB p65抗體購自武漢博士德有限公司。

1.2 模型建立及干預(yù) 將72只大鼠隨機分為假手術(shù)組(對照組)、模型組和七氟醚組各24只。后兩組參考 Basile 等［6］方法制作腎缺血再灌注損傷模型。七氟醚組制模前1 h吸入七氟醚:大鼠置于自制的有機玻璃麻醉箱內(nèi)，通過麻醉氣體揮發(fā)罐輸入O2和七氟醚的混合氣體，用麻醉氣體監(jiān)測儀持續(xù)測定藥物濃度，使實驗艙七氟醚濃度維持在2.2%。

1.3 觀察項目 制模后4、12、24 h各組分別處死大鼠8只，行以下項目觀察。①血清BUN和Cr水平:眼眶取血，采用生化分析儀常規(guī)方法測定。②腎組織病理學(xué)變化:取左腎縱切用10%中性甲醛固定，常規(guī)乙醇脫水，石蠟包埋后切片行蘇木精—伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡觀察。③腎組織NF－κB表達:取上述石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫臘，梯度乙醇入水后，免疫組化法檢測。NF－κB陽性表達為棕黃色顆粒，定位于細胞核。于10×40倍光鏡下隨機選取10個視野計數(shù)陽性細胞，用圖像采集系統(tǒng)將圖像輸入計算機并進行人工分析，取平均值。④腎組織NOS活性:取右腎組織于冰生理鹽水中漂洗、濾紙拭干、稱重后用0.86%冷生理鹽水制備10%組織勻漿，根據(jù)試劑盒說明檢測總NOS(TNOS)及誘生型NOS(iNOS)、原生型NOS(cNOS)活性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量數(shù)據(jù)以±s表示，多組比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組內(nèi)兩兩比較采用LSD法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清BUN及Cr水平 各組血清BUN及Cr水平見表1。

2.2 腎組織病理學(xué)變化 對照組腎單位結(jié)構(gòu)未見明顯異常;模型組早期腎小球及腎間質(zhì)血管擴張充血，腎小管上皮細胞發(fā)生水腫，部分腎小管管腔變窄，少數(shù)管腔可見管型，間質(zhì)有極少量炎性細胞浸潤，隨再灌注時間延長，損傷加重，24 h時低倍鏡下可見皮質(zhì)區(qū)變性廣泛，腎小管管腔可見管型，高倍鏡下見部分腎小球出現(xiàn)變性壞死，腎小管變性壞死廣泛，出現(xiàn)核固縮、溶解、消失，腎小管上皮細胞壞死脫落，變性壞死區(qū)有炎性細胞浸潤。七氟醚組病理變化較模型組明顯減輕，腎臟外觀與對照組接近，光鏡下可見腎小球擴張充血、局部腎間質(zhì)充血，但較模型組明顯減輕，無明顯炎細胞浸潤，局部腎小管未出現(xiàn)管型、輕度水樣變性。

表1 各組血清BUN及Cr水平比較(n=8，±s)

表1 各組血清BUN及Cr水平比較(n=8，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與模型組同時相比較，#P ＜0.05

檢測指標 模型組 七氟醚組 對照組BUN(nmol/L)4 h 14.69 ± 0.99* 14.20 ±1.16* 6.73 ±1.06 12 h 34.45 ± 6.22* 15.63 ±2.90*# 6.58 ±1.49 24 h 45.41 ±11.03* 12.91 ±2.97*# 7.31 ±1.94 Cr(μmol/L)4 h 105.57 ± 6.37* 101.84 ±10.06*#73.41 ±7.64 12 h 191.34 ±56.81* 99.36 ±13.95*#75.54 ±7.51 24 h 209.63 ±54.27* 98.11 ±13.42*#73.90 ±8.89

2.3 腎組織NF－κB表達 NF－κB表達均定位于腎小管上皮細胞，腎小球中未見表達。對照組NF－κB幾乎不表達;各組NF－κB表達情況見表2。

表2 各組腎組織NF-κB表達比較(n=8，陽性細胞數(shù)，±s)

表2 各組腎組織NF-κB表達比較(n=8，陽性細胞數(shù)，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與模型組同時間比較，#P ＜0.05

4 h 12 h 24 h模型組 79.65 ±17.17* 97.62 ±21.21* 108.81 ±15.22組別*七氟醚組 26.09 ± 6.87*# 20.62 ± 7.74*# 28.58 ± 7.43*#對照組1.85 ± 1.12 1.69 ± 1.09 1.74 ± 1.23

2.4 腎組織NOS活性 各組腎組織NOS活性比較見表3。

表3 各組腎組織NOS活性比較(n=24，U/mg prot，±s)

表3 各組腎組織NOS活性比較(n=24，U/mg prot，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與模型組同時相比較，#P ＜0.05

組別TNOS iNOS cNOS模型組4 h 0.658 ±0.096 0.250 ±0.010* 0.407 ±0.059 12 h 0.818 ±0.245* 0.276 ±0.009* 0.542 ±0.103 24 h 0.924 ±0.303* 0.352 ±0.039* 0.572 ±0.221七氟醚組4 h 0.564 ±0.072 0.162 ±0.010*# 0.402 ±0.049 12 h 0.596 ±0.101# 0.185 ±0.009*# 0.416 ±0.089 24 h 0.630 ±0.128# 0.223 ±0.010*# 0.413 ±0.079對照組4 h 0.528 ±0.020 0.097 ±0.026 0.397 ±0.146 12 h 0.534 ±0.013 0.113 ±0.012 0.431 ±0.074 24 h 0.530 ±0.041 0.104 ±0.035 0.419 ±0.086

3 討論

NF－κB是一種多功能核轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下NF－κB 與 κB 抑制蛋白(I－κB)結(jié)合成無活形式存在于細胞質(zhì)中，當其受氧自由基、內(nèi)毒素、細胞因子等的刺激后被激活導(dǎo)致NF－κB快速從胞質(zhì)移位進入細胞核內(nèi)，結(jié)合在被誘導(dǎo)基因啟動子上特異的κB位點，調(diào)控相應(yīng)的靶基因表達。近年來研究發(fā)現(xiàn)，NF－κB信號系統(tǒng)參與了缺血再灌注損傷過程;抑制NF－κB活性可降低炎性介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，減輕中性粒細胞的聚集，從而對再灌注損傷的組織產(chǎn)生保護作用［2］。七氟醚是一種揮發(fā)性麻醉藥，研究發(fā)現(xiàn)其可通過抑制心肌細胞NF－κB活化、減少TNF－α產(chǎn)生減輕大鼠離體心肌缺血再灌注損傷［7］。Thomas等［8］發(fā)現(xiàn)，異氟醚、七氟醚、地氟醚等吸入麻醉藥可減輕腎臟缺血再灌注損傷，其作用機制與抑制炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF－κB的結(jié)合活性有關(guān)。Lee等［9］在大鼠腎臟缺血再灌注模型研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚預(yù)處理能保護腎小球濾過功能。

腎缺血再灌注損傷的機制十分復(fù)雜，涉及氧自由基產(chǎn)生、鈣超載、中性粒細胞浸潤、細胞凋亡，以及血管內(nèi)皮損傷等多種病理生理過程，其中有眾多炎性介質(zhì)和免疫因子的參與［10，11］。腎臟缺血再灌注時產(chǎn)生大量過氧化物和超氧自由基，激活NF－κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起細胞因子、黏附分子以及炎癥反應(yīng)酶類(如iNOS)等物質(zhì)過度表達，參與腎缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展。NOS是催化合成內(nèi)源性一氧化氮的酶，目前已知NOS有兩類同工酶:原生型(constitutive NOS，cNOS)和誘生型(inducible NOS，iNOS)。NO在腎臟中的作用有直接和間接兩種，直接作用即對腎臟的保護作用，間接作用即NO的毒性作用，前者由 cNOS介導(dǎo)，而后者由 iNOS介導(dǎo)［12］。有研究顯示［13］，再灌注后腎實質(zhì)中兩種NOS mRNA表達均較缺血時顯著上調(diào)，且以iNOS最為明顯。iNOS的過表達會催化產(chǎn)生高濃度NO，直接造成細胞損傷，使腎功能進一步受損。本研究結(jié)果顯示模型組腎組織NF－κB表達明顯增加，隨再灌注時間的延長進行性增加，iNOS活性也顯著增強。腎功能指標BUN、Cr呈進行性升高，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的病理變化，腎小球毛細血管明顯擴張充血，腎間質(zhì)充血、炎性細胞浸潤，腎小管管腔可見管型，腎小管上皮細胞變性壞死，出現(xiàn)核固縮、溶解、消失，以24 h受損最為嚴重。七氟醚預(yù)處理組NF－κB的表達、iNOS的活性顯著低于模型組;BUN、Cr均明顯低于同時相的模型組;光鏡下觀察腎組織結(jié)構(gòu)受損程度較模型組明顯減輕。證實七氟醚預(yù)處理可減弱NF－κB活化、降低炎性介質(zhì)表達，減輕腎缺血再灌注損傷。

本研究結(jié)果提示NF－κB是腎缺血再灌注損傷的重要調(diào)控因子，抑制NF－κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是七氟醚預(yù)處理減輕腎缺血再灌注損傷的作用機制。

［1］Rodriguez－Pe?a A，Garcia－Criado FJ，Eleno N，et al.Intrarenal administration of a molecule releasing nitric oxide，reduces renal ischemia－reperfusion injury in rats［J］.American Journal of Transplantation，2004，4(10):1605－1613.

［2］Souza DG，Teixeira MM.The balance between the production of tumor necrosis factor－α and interleukin－10 determines tissue injury and lethality during intestinal ischemia and reperfusion［J］.Mem Inst Oswaldo Cruz，2005，100(Suppl，1):59－66.

［3］張厚忠，李紅霞，王漢中.七氟醚和缺血預(yù)處理對大鼠血清MDA和肝臟組織HSP70表達的影響［J］.中國老年學(xué)雜志，2008，28(16):1586－1587.

［4］李愛芝，馬加海，丁永波，等.七氟醚對大鼠急性腎缺血－再灌注損傷的保護作用［J］.臨床麻醉學(xué)雜志，2008，24(8):690－692.

［5］儲曉英，薛慶生，于布為.七氟醚對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用［J］.中華麻醉學(xué)雜志，2006，26(1):65－67.

［6］Basile DP，Donohoe D，Cao X，et al.Resistance to ischemic acute renal failure in the Brown Norway rat:a new model to study cytoprotection ［J］.Kidney Int，2004，65(6):2201－2211.

［7］Zhong C，Zhou Y，Liu H.Nuclear factor kB and anesthetic preconditioning during myocardial ischemia－reperfusion［J］.Anesthesiology，2004，100(3):540－546.

［8］曾因明，鄧小明.2007麻醉學(xué)新進展，北京:人民衛(wèi)生出版社，2007:34.

［9］Lee HT，Hua Xu，Charles W.Sevoflurane protects against renal ischemic reperfusion injury in rats［J］.Anesthesiology，2002，96(2):A411－A414.

［10］Rah DK，Han DW，Baek HS，et al.Protection of rabbit kidney from ischemia/reperfusion injury by green tea polyphenol pretreatment［J］.Arch Pharm Res，2007，30(11):1447－1454.

［11］Bojakowski K，Gaciong Z，Grochowiecki T，et al.Carbon monoxide may reduce ischemia reperfusion injury:a case report of complicated kidney transplantation from a carbon monoxide poisoned donor［J］.Transplant Proc，2007，39(9):2928－2929.

［12］Anaya－Prado R，Toledo－Pereyra LH.The molecular events underlying ischemia/reperfusion injury［J］.Transplant Proc，2002，34(7):2518－2519.

［13］Kin S，Sasaki T，Gu K，et al.The cytoprotective role of nitric oxide in ischemia－reperfusion injury in the rat kidney［J］.Transplant Proc，1995，27(1):754－756.