骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合藻酸鹽治療椎間盤退變的實驗研究

巢玉柳 金永 卞敏凱 張亮 蔣純志

椎間盤退變是臨床的常見病。本實驗擬將兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （Bone Mesenchymal stem cells，BMSC）結(jié)合藻酸鹽凝膠，治療兔椎間盤退變，觀察其可行性和治療效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料

新西蘭大白兔 （南京醫(yī)科大學(xué)動物中心），3月齡，1～1.8 Kg， 雌雄不限；DMEM 培養(yǎng)基 （Gibco公司）；胎牛血清（天津市北辰盛達(dá)生物制品廠）；藻酸鹽（Sigma公司）；鼠抗人Ⅱ型膠原抗體以及 Elivision plus免疫組化試劑盒（邁新公司）；硫酸軟骨素、木瓜蛋白酶（Sigma公司）；二甲基亞甲藍(lán)（Aldrich公司）。

1.2 方法

1.2.1 移植物的制備

1.2.1.1 BMSC的培養(yǎng)和鑒定

實驗兔以3%戊巴比妥（1 mL/Kg）耳緣靜脈麻醉，股骨抽取骨髓約3 mL，F(xiàn)ICOLL淋巴細(xì)胞分層液密度梯度離心，取中層單細(xì)胞懸液，加入DMEM培養(yǎng)液，貼壁法分離、培養(yǎng)BMSC。接種后5 d首次換液，以后每3天換液，約2周后細(xì)胞基本鋪滿單層后傳代。倒置相差顯微鏡觀察，貼壁的BMSC細(xì)胞呈長梭形，旋渦狀排列，形成集落。

1.2.1.2 藻酸鹽凝膠制備和體外BMSC復(fù)合體構(gòu)建

將藻酸鈉用三蒸水制成1.2%溶液，高溫高壓消毒備用。準(zhǔn)備無菌100 mL氯化鈣溶液。將已備好的BMSC懸液以1×106cells/mL濃度與藻酸鈉混勻后緩慢滴入氯化鈣溶液，可形成均勻的凝膠，吸取多余氯化鈣溶液，加入DMEM培養(yǎng)液。2 d后換液，鏡下觀察三維支架內(nèi)的細(xì)胞生長良好，切片，HE染色。

1.2.2 動物模型制備及實驗分組

1.2.2.1 動物模型制備

取15只健康新西蘭大白兔，麻醉，取腹部后外側(cè)縱行切口，經(jīng)腹膜外入路鈍性分離腰肌到達(dá)椎體側(cè)方，必要時破壞橫突，暴露 L2/3、L3/4、L4/5、L5/6椎間隙，16號注射器針頭刺入椎間隙5 mm，反復(fù)穿刺10次，并抽吸髓核組織。術(shù)后一天禁食，抗炎、補(bǔ)液。

1.2.2.2 實驗分組

將制備的動物模型隨機(jī)分為3組：治療組、對照組和空白組，每組5只。在治療組為方便復(fù)合體植入，藻酸鹽凝膠在椎間盤內(nèi)完成，將已備好的BMSC細(xì)胞懸液以1×106cells/mL細(xì)胞濃度與藻酸鈉混勻后，微量注射器向損傷的椎間隙注射30 μL，然后從原針道注射氯化鈣30 μL，在體內(nèi)完成凝膠過程；對照組只注入沒有細(xì)胞的藻酸鹽凝膠；空白組在損傷椎間盤后注射生理鹽水20 μL。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 腰椎MRI檢查

術(shù)前 1 d、術(shù)后 2、4、8、12 周，連續(xù)行 MRI檢查。靜脈麻醉下進(jìn)行MRI檢查，采用自旋回波序列，TR：3 500 ms，TE 116 ms； 層厚 3 mm， 層間距 1 mm。Dabbs method的方法測量椎間隙高度，并測量髓核T2值，計算手術(shù)前后變化比值。

1.3.2 病理組織學(xué)及免疫組化

實驗兔術(shù)后12周取材。原切口進(jìn)入，迅速游離脊柱腰段。切開椎間隙，大體觀察椎間盤組織，取材。10%福爾馬林固定24 h，脫鈣1周，沿正中矢狀面縱行切開，制成蠟塊，常規(guī)切片，厚 5 μm，HE 染色；按照Elivision plus免疫組化試劑盒說明書的方法進(jìn)行免疫組化，檢測組織中Ⅱ型膠原，一抗使用鼠抗人Ⅱ型膠原單抗。免疫組化結(jié)果以細(xì)胞外間質(zhì)黃染為陽性，應(yīng)用Leica Q550 IW計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，定量評價呈陽性染色的細(xì)胞外間質(zhì)的灰度值 （灰度分級0～255級，0級為最深，255級為最淺），測得結(jié)果為視野內(nèi)棕黃色的平均灰度值 （每張切片隨機(jī)采集4個高倍視野進(jìn)行測定，200×）。

1.3.3 腰椎間盤髓核蛋白多糖的測定

200 μL/mL木瓜蛋白酶（含 50 mmol/L EDTA，5 mmol/L L-半胱氨酸）消化椎間盤組織24 h。取25 μL消化液與 125 μL二甲基亞甲藍(lán)（3.04 g甘氨酸，2.37 g氯化鈉，95 mL 0.1 M鹽酸，16 mg二甲基亞甲藍(lán)）混合，紫外分光光度計測量530 nm吸光值，用硫酸軟骨素制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腰椎間盤MRI的變化

術(shù)后2周MRI檢查顯示3個組的椎間盤都出現(xiàn)退變表現(xiàn)，椎間隙狹窄，T2像上椎間盤信號減弱，（退變程度見表1，2）。 MRI檢查測量手術(shù)前后椎間盤高度變化的比值，3組的椎間盤高度均有不同程度降低，其中治療組變化最小。MRI檢查測量手術(shù)前后椎間盤T2信號變化的比值，3組的椎間盤T2值均有不同程度降低，其中治療組變化最小。3組的兔腰椎間盤手術(shù)前后5個時間點(diǎn)對比，發(fā)生不同程度退變，治療組的退變程度明顯輕于對照組和空白組。術(shù)后12周的3組椎間盤高度和T2值手術(shù)前后的變化比值經(jīng)方差分析，P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3組數(shù)據(jù)再行兩兩比較，治療組與對照組、治療組與空白組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），對照組與空白組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 大體觀察與病理組織學(xué)結(jié)果

空白組和對照組術(shù)后12周椎間盤剖面大體觀察示退變明顯，椎體邊緣骨贅形成，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)分界不清，髓核組織萎縮纖維化，出現(xiàn)裂隙；治療組輕度退變，組織結(jié)構(gòu)尚可分清，髓核組織結(jié)構(gòu)飽滿膠凍狀。

HE染色示，空白組和對照組纖維環(huán)邊緣破裂，髓核組織被纖維軟骨樣組織代替，而且皺縮出現(xiàn)空隙，髓核細(xì)胞數(shù)量減少。治療組結(jié)構(gòu)飽滿，髓核細(xì)胞成團(tuán)排列均勻。

2.3 蛋白多糖和Ⅱ型膠原含量的變化

12周時空白組椎間盤髓核蛋白多糖的含量為(4.875±0.696)mg/100 mg，對照組(5.112±0.891)mg/100 mg，治療組(6.135±0.771)mg/100 mg，空白組和對照組均明顯低于治療組（P<0.05）。治療組與對照組、治療組與空白組具有顯著差異（P<0.05），對照組與空白組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

12周后，Ⅱ型膠原免疫組化染色示治療組椎間盤組織陽性染色強(qiáng)于對照組與空白組。經(jīng)圖像分析儀半定量測定，空白組 （151.112±1.997），對照組（150.652±2.357），治療組（142.14 ±1.754）；治療組與對照組、治療組與空白組具有顯著差異（P<0.05），對照組與空白組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表1 椎間盤術(shù)前與術(shù)后高度比值變化Table The ratio change of disc height Pre-and Post-operation

表2 椎間盤術(shù)前與術(shù)后T2值變化比較Table The ratio change of T2 value pre-and post-operation

圖1 免疫組化檢測各組椎間盤II型膠原（Elivision，200×）Fig.1 Collagen type II of intervertebral disc detected by immunohistochemical （Elivision，200×）

3 討論

椎間盤退變是一個十分緩慢的過程。 Sahlman等[1]應(yīng)用雜合敲除技術(shù)使小鼠表達(dá)Ⅱ型膠原的Col2a1基因失活，通過影像學(xué)、偏光顯微鏡和免疫組化等方法觀察發(fā)現(xiàn)，椎體終板增厚鈣化，蛋白多糖減少，繼而發(fā)生椎間盤退變。這些變化表現(xiàn)在MRI上，可見椎間隙狹窄，代表含水量的T2信號強(qiáng)度減弱。本實驗采取針刺法建立腰椎間盤退變的動物模型，術(shù)后2周MRI檢查顯示椎間盤均發(fā)生退變，椎間隙變得狹窄，T2信號減弱；術(shù)后12周大體及病理切片顯示，退變椎間盤萎縮纖維化。實驗組，移植BMSC結(jié)合藻酸鹽支架，術(shù)后12周大體觀察見組織結(jié)構(gòu)飽滿，Ⅱ型膠原、蛋白多糖含量多于其他2組，說明對退變椎間盤具有修復(fù)作用。

BMSC是具有自我更新能力且在適宜微環(huán)境下具有多向分化潛能的細(xì)胞，可在體外分化培養(yǎng)擴(kuò)增，傳代穩(wěn)定，可分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等。BMSC來源廣泛，生物活性強(qiáng)。有研究認(rèn)為，同種異基因的間充質(zhì)干細(xì)胞對宿主的T細(xì)胞免疫反應(yīng)有免疫抑制效應(yīng)，可減輕免疫排斥[2]，使異基因間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用存在可能。在本實驗中，也未觀察到因移植引起明顯免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。已有報道將BMSC作為種子細(xì)胞可在體外向髓核細(xì)胞分化[3－4]。

Sakai等[5]將兔自體間充質(zhì)干細(xì)胞植入膠原凝膠支架，培養(yǎng)后再植入兔髓核中，結(jié)果顯示膠原凝膠其可延緩椎間盤退變。

作為組織工程化椎間盤的支架要求具有良好的生物相容性（包括組織相容性和細(xì)胞相容性）、良好的生物降解性，并具備三維立體多孔結(jié)構(gòu)和可塑性及一定的機(jī)械強(qiáng)度，要保證良好的材料-細(xì)胞界面。

藻酸鹽是一種彈性無水D－甘露糖醛酸的聚合體，聚合體相對分子質(zhì)量為5 000～15 000。在鈣離子等二價離子存在時，通過離子交聯(lián)作用聚合成開放晶格形式的三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定的水凝膠。因其使用方便和良好的組織相容性，在組織工程骨和軟骨的研究中被廣泛應(yīng)用。Horner等[6]從小牛尾部椎間盤分別取關(guān)節(jié)軟骨、髓核、內(nèi)外層纖維環(huán)，用35S標(biāo)記后進(jìn)行藻酸鹽、膠原凝膠及單層培養(yǎng)，結(jié)果顯示應(yīng)用藻酸鹽底物時細(xì)胞增殖最快，單層培養(yǎng)最慢。

本實驗采取藻酸鹽在椎間盤內(nèi)局部注射，完成凝膠過程，操作方便，顯示BMSC結(jié)合藻酸鹽凝膠支架能增加髓核中蛋白多糖的合成，具有修復(fù)腰椎間盤退變的能力，有望成為治療椎間盤退變的生物學(xué)方法。

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[3]Richardson SM,Walker RV,Parker S,et al.The Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation[J].Stem cells,2006,24(3):707-716.

[4]Richardson SM,Curran JM,Chen R,et al.The differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into chondrocyte-like cells on poly-L-lactic acid(PLLA)scaffolds[J].Biomaterials,2006,27(22):4069-4078.

[5]SakaiD,MochidaJ,YamamotoY,etal.Transplantationofmesenchymal stem cells embedded in atelocollagen(R)gel to the intervertebral disc:a potential therapeutic model for disc degeneration[J].Biomaterials,2003,27(20):3531-3541.

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