骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)兔預(yù)構(gòu)皮瓣成活的實(shí)驗(yàn)研究

丁志 鄧辰亮 鄭江紅 萬偉東 茅廣宇 楊松林

隨著再生醫(yī)學(xué)的興起，細(xì)胞治療得到不斷發(fā)展，干細(xì)胞因具有多向分化潛能和自我復(fù)制能力而備受關(guān)注。其中，間充質(zhì)干細(xì)胞因來源廣泛，分離培養(yǎng)容易，增殖和多向分化能力強(qiáng)，已成為干細(xì)胞治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，被廣泛報(bào)道應(yīng)用于各種病損的組織器官。近年來的諸多研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）除能分化為多種參與血管形成的細(xì)胞外，還能分泌 VEGF、IGF、EGF、KGF、TGF、SDF1 等多種促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子[1-2]，促進(jìn)血管再生、改善局部血供，已用于治療心肌缺血、缺血皮瓣的成活等[3-5]。而預(yù)構(gòu)皮瓣成功的關(guān)鍵也是血管再生，因此用間充質(zhì)干細(xì)胞來促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣的成活應(yīng)是可行的。因此，本研究在將兔股動(dòng)靜脈血管束植入其腹部皮下的同時(shí)，向血管束周圍注射BMSC懸液，通過觀察其分化作用和旁分泌作用，以及對預(yù)構(gòu)皮瓣成活的影響，探討B(tài)MSC促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣存活的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司，美國）；兔抗人VEGF單克隆抗體、FITC標(biāo)記的BrdU特異性單克隆抗體（Roche公司，瑞典）；耐光性菁染料cyb3標(biāo)記的vWF多克隆抗體 （Santa Cruz公司，加拿大）；小鼠抗兔-CD45-FITC、小鼠抗兔-CD90-FITC（Caltage 公司，美國）；小鼠抗兔-CD34-FITC、小鼠抗兔-CD45-FITC（Santa Cruz公司，加拿大）；BrdU（溴脫氧尿嘧啶）、CFDA-SE（羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯）（友誼中聯(lián)生物科技公司，中國）；山羊抗兔羅丹明 （武漢博士德公司，中國）；PVDF膜 （Millipore公司，美國）；ECL發(fā)光試劑盒（Thermo 公司，美國）；流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson公司，美國）；電泳儀 EPS-300（天能，中國）；16 只健康雄性新西蘭大白兔（上海生旺實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖場，中國）。

1.2 方法

1.2.1 BMSC的分離培養(yǎng)

體質(zhì)量約3 Kg的健康新西蘭大白兔，麻醉狀態(tài)下用骨髓穿刺針抽取左側(cè)髂骨骨髓，置入15 mL離心管中，1 000 r/min離心10 min，棄上清，用移液槍吸取含15%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液至離心管，反復(fù)吹打使之充分混合，接種于25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置入37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)液，除去未貼壁的細(xì)胞，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。之后每3天更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞達(dá)到90%融合后，0.25%胰蛋白酶37℃消化1 min，培養(yǎng)液中止胰酶消化，按1∶3傳代；同前法換液，至10～12 d細(xì)胞90%融合時(shí)，按1∶3的比例再次進(jìn)行傳代接種培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)過程中每3天換液一次，直至貼壁細(xì)胞彼此融合，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶的底面，重復(fù)以上操作。

1.2.2 BMSC的鑒定

取培養(yǎng)至第3代的貼壁細(xì)胞，0.25%的胰酶消化法收集細(xì)胞，分別取1×106個(gè)細(xì)胞與抗CD34、CD45、CD29、CD90 抗體（效價(jià)均為 1∶50）室溫孵育30～40 min，0.1 mol/L PBS洗滌 2次，滴加 FITC 標(biāo)記的二抗，避光孵育30 min，0.1 mol/L PBS洗滌2次后懸浮，采用流式細(xì)胞儀分析。

1.2.3 BMSC的體外BrdU和CFDA-SE標(biāo)記

取第3代BMSC，移植前48 h對細(xì)胞進(jìn)行換液，用含1%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，培養(yǎng)瓶中加入5 μmol/L的BrdU，37℃孵育24 h，離心法收集細(xì)胞，PBS重懸細(xì)胞。加入等體積的10 μmol/L CFDA-SE，于37℃孵育10 min，用完全培養(yǎng)基離心洗滌細(xì)胞2次，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記情況。

1.2.4 預(yù)構(gòu)皮瓣模型制備

16只健康雄性新西蘭大白兔共構(gòu)建32個(gè)預(yù)構(gòu)皮瓣，每只實(shí)驗(yàn)兔的腹部兩側(cè)各構(gòu)建一個(gè)股動(dòng)靜脈血管束預(yù)構(gòu)腹部皮瓣，分別為實(shí)驗(yàn)組（n=16）和對照組（n=16）。3%戊巴比妥鈉自耳緣靜脈內(nèi)注射麻醉，實(shí)驗(yàn)兔腹部兩側(cè)各標(biāo)記4 cm×2 cm矩形預(yù)構(gòu)區(qū)，短邊平行于腹股溝韌帶，自尾側(cè)短邊中點(diǎn)向后縱向切開后肢皮膚，顯微鏡下剝離出長約4 cm的股動(dòng)靜血管束，遠(yuǎn)端結(jié)扎切斷。在兩側(cè)預(yù)構(gòu)區(qū)域的中軸線上，于真皮與肉膜層間各制作一皮下隧道，向?qū)嶒?yàn)組每個(gè)隧道壁分4個(gè)點(diǎn)經(jīng)皮注射濃度為5×106cells/mL的BMSC懸液，每點(diǎn)注射0.05 mL，同法向?qū)φ战M隧道壁注射等量的生理鹽水。將已剝離好的股血管束翻轉(zhuǎn)置入相應(yīng)的皮下隧道。所有預(yù)構(gòu)區(qū)域均在術(shù)后2周沿原標(biāo)記線切開皮膚，于肉膜層下剝離形成由植入的股血管束為軸心血管的島狀皮瓣（圖1）。

1.2.5 BMSC移植后的追蹤觀察

構(gòu)建預(yù)構(gòu)皮瓣模型術(shù)后1周，從兩組中各隨機(jī)選取1個(gè)預(yù)構(gòu)區(qū)域切下行冰凍切片，丙酮固定，熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記有CFDA-SE的BMSC，觀察綠色熒光的量，以反映BMSC的增殖和分布情況。

1.2.6 預(yù)構(gòu)皮瓣VEGF的Western Blot半定量分析

從兩組中分別隨機(jī)選取3個(gè)預(yù)構(gòu)島狀皮瓣，共6個(gè)皮瓣樣本置于干冰上，每樣本切取大約200 mg組織，加入1 mL 4℃預(yù)冷的T-PER（Tissue Protein Extraction Reagent）組織裂解液，使用電動(dòng)勻漿器進(jìn)行組織勻漿，4℃條件下10 000 g離心5 min，收集上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行總蛋白濃度檢測。調(diào)整蛋白濃度至10 μg/μL，-20℃保存。制膠（12%分離膠），蛋白上樣，電泳，濕法轉(zhuǎn)膜（400 mA橫流1 h），PVDF膜用溶解有5%脫脂奶粉的TBST封閉（常溫封閉 2 h），加入 VEGF 一抗（TBST，1∶100稀釋），4 ℃過夜，TBST 洗膜，加入二抗（TBS，1∶100稀釋）， 室溫反應(yīng)1 h，TBST洗膜，ECL （Pierce ECL Western Blotting Substrate，32106）顯色 1 min，暗室曝光X線片，應(yīng)用灰度分析軟件進(jìn)行光密度分析。

1.2.7 預(yù)構(gòu)皮瓣的免疫熒光化學(xué)染色

從兩組中各隨機(jī)選取4個(gè)預(yù)構(gòu)島狀皮瓣，共8個(gè)皮瓣樣本，制作連續(xù)冰凍切片，順序加入vWF一抗（1∶200）和羅丹明標(biāo)記的二抗(1∶100)，以非特異血清代替一抗作為陰性對照，室溫下孵育2 h，PBS洗片；再順序加入針對 BrdU 的一抗（1∶100），二抗為FITC 標(biāo)記(1∶100)，室溫下孵育 2 h，PBS 洗片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.8 預(yù)構(gòu)島狀皮瓣存活率大體觀察

兩組中余下的各8個(gè)島狀皮瓣均縫回原處，形成島狀皮瓣后的第七天，麻醉動(dòng)物，觀察皮瓣顏色、皮溫、彈性質(zhì)地和毛發(fā)生長情況，相同物距下用數(shù)碼相機(jī)（Canon 550D）進(jìn)行皮瓣攝像，圖像輸入計(jì)算機(jī)，應(yīng)用Image-Pro Plus.V5.0，經(jīng)圖像增強(qiáng)、分割、待測面積的二值化處理，精確測量皮瓣存活部分及壞死部分面積，根據(jù)公式計(jì)算出各皮瓣存活率。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 BMSC的形態(tài)學(xué)觀察

原代細(xì)胞在接種24 h后，可見部分貼壁的圓形細(xì)胞；48～72 h 后，細(xì)胞呈紡錘形、梭形、多角形，48 h后這些細(xì)胞形成明顯的細(xì)胞集落，大小不一，每個(gè)集落約由十幾到幾十個(gè)細(xì)胞組成，細(xì)胞集落逐漸增多、增大，集落之間相互靠進(jìn)；12～15 d可達(dá)到90%融合，融合后呈旋渦狀。以1∶3傳代的細(xì)胞24 h內(nèi)完全貼壁，4～6 d內(nèi)達(dá)到90%融合。原代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)局部區(qū)域有少許小而圓的細(xì)胞，傳代后消失。第2代以后，細(xì)胞形態(tài)貼壁細(xì)胞形態(tài)呈梭形﹑三角形﹑扇形和圓形，平鋪生長，不再形成明顯的集落（圖2）。

2.2 BMSC的鑒定

流式細(xì)胞儀分析顯示，第3代細(xì)胞均一性較好，達(dá)99%以上，BMSC具有獨(dú)特的免疫學(xué)表型，造血譜和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD34和CD45呈陰性表達(dá)，間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記CD29、CD90呈陽性表達(dá)，說明傳代貼壁生長的梭形細(xì)胞為BMSC。

2.3 BMSC懸液注射后1周的觀察

BMSC懸液注射入預(yù)構(gòu)區(qū)隧道壁后1周，熒光顯微鏡下觀察冰凍切片，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組皮下組織內(nèi)均勻分布綠色的BMSC，并參與到小血管壁中；對照組內(nèi)未發(fā)現(xiàn)綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞（圖3）。

2.4 島狀皮瓣存活率的大體觀察

形成島狀皮瓣時(shí)，未發(fā)現(xiàn)股血管栓塞現(xiàn)象，島狀預(yù)構(gòu)皮瓣形成后7 d，實(shí)驗(yàn)組皮瓣大部分成活良好，顏色粉紅，皮溫正常，有毛發(fā)生長，彈性及質(zhì)地與周圍正常皮膚組織相似，僅邊緣部分少許區(qū)域顏色暗紅；對照組皮瓣近一半?yún)^(qū)域皮膚顏色變黑、組織回縮、彈性差、質(zhì)地變硬、切割組織不出血。經(jīng)圖像分析，實(shí)驗(yàn)組和對照組皮瓣存活率分別為（93.1±2.6）%和（51.5±7.5）%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.5 Western Blot檢測結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組皮瓣組織內(nèi)VEGF含量明顯高于對照組（圖 4），兩組間差異顯著（P＜0.05）。

2.6 BrdU/vWF免疫熒光雙標(biāo)記檢測

免疫熒光雙標(biāo)檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞懸液注射后第14天，實(shí)驗(yàn)組免疫熒光組織切片可見大量BrdU染色陽性的細(xì)胞，胞核呈現(xiàn)綠色熒光，胞漿中有紅色熒光信號，含有雙色熒光的細(xì)胞密集地整合在血管壁中，對照組免疫熒光組織切片未發(fā)現(xiàn)綠色及紅色熒光信號表達(dá)的細(xì)胞（圖5）。

圖1 預(yù)構(gòu)皮瓣模型制備Fig.1 The preparation of prefabricated flap model

圖2 BMSC的形態(tài)學(xué)觀察（光鏡，200×）Fig.2 Morphology observationof BMSC （Light microscope,200×）

圖3 BMSC移植后第7天Fig.3 Morphology observation of BMSC on the 7thday after transplantation

圖4 預(yù)構(gòu)皮瓣內(nèi)VEGF的Western Blot半定量測定（Line1、3、5 為對照組；Line2、4、6 為實(shí)驗(yàn)組；*：P＜0.05）Fig.4 Western Blot semi-quantitative analysis of VEGF protein levels from different groups.The mean VEGF level was higher in the flaps of BMSCs group when compared with control groups(P＜0.05)

圖5 BrdU/VWF免疫雙標(biāo)熒光染色（100×）Fig.5 The BrdU/vWF bone mesenchymal stem cells positive stain aggregate especially in flaps from experiment group at 14 days after transplantation

3 討論

預(yù)構(gòu)皮瓣成功的關(guān)鍵是血管載體與預(yù)構(gòu)區(qū)域之間建立起充分的血管連接，即血管再生。血管再生包括血管新生和血管生成兩個(gè)基本過程[6]，前者是指內(nèi)皮前體細(xì)胞分化為成內(nèi)皮細(xì)胞，形成原始血管網(wǎng)的過程；后者是指從已存在的血管，以出芽方式長出新毛細(xì)血管的過程。過去曾認(rèn)為血管新生只發(fā)生在胎兒期，近來發(fā)現(xiàn)成體內(nèi)也有內(nèi)皮前體細(xì)胞，即內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生過程。因此，要促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣內(nèi)的血管再生，就要增加局部內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和促進(jìn)已存在的血管出芽生長。許多研究表明，VEGF、bFGF、TGF-β等多肽類生長因子能明顯促進(jìn)已存在的血管出芽生長，增加了預(yù)構(gòu)皮瓣內(nèi)的血管密度，從而提高了預(yù)構(gòu)皮瓣的存活率[7-8]。但這些生長因子半衰期都很短，有潛在的副作用，療效有限[9-10]。近年來，干細(xì)胞的治療性血管再生作用引起了廣泛關(guān)注，其中BMSC因?yàn)橐蛉〔姆奖?、可體外大量培養(yǎng)增殖、免疫原性低以及能分泌多種細(xì)胞因子等優(yōu)點(diǎn)，而成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。BMSC移植后不僅通過分化為相應(yīng)的功能細(xì)胞發(fā)揮作用，而且還 可 以 分 泌 VEGF、IGF、EGF、KGF、TGF、Ang1、SDF1等多種細(xì)胞因子，共同促進(jìn)血管生成，已有報(bào)道用BMSC來治療心肌缺血、外周缺血性疾病，以及促進(jìn)缺血皮瓣的成活、創(chuàng)面愈合等，但用BMSC促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣的血管再生尚未見報(bào)道。因此，我們在本研究中探索了BMSC促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣成活的可行性。實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)組島狀皮瓣的平均成活率明顯高于對照組，證實(shí)了BMSC同樣能促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣的成活。我們在形成島狀皮瓣時(shí)，肉眼觀察到實(shí)驗(yàn)組股血管束周圍小血管明顯較對照組豐富，且所有皮瓣中均沒有發(fā)現(xiàn)植入的股血管束發(fā)生栓塞，所以對照組的島狀預(yù)構(gòu)皮瓣較大范圍皮膚壞死只能是皮瓣中小血管再生不充分造成的。

本實(shí)驗(yàn)中，通過對預(yù)構(gòu)皮瓣中VEGF的Western Blot半定量分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組皮瓣組織內(nèi)VEGF含量明顯高于對照組，說明BMSC懸液注射到預(yù)構(gòu)皮瓣內(nèi)，可增加皮瓣內(nèi)VEGF的含量。我們也發(fā)現(xiàn)對照組皮瓣內(nèi)有少量VEGF，可能是由于手術(shù)創(chuàng)傷引起皮瓣局部組織炎癥、缺氧而產(chǎn)生的少量內(nèi)源性VEGF。

有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，BMSC能在體內(nèi)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞[5，11]。我們通過免疫熒光雙標(biāo)記檢測發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組皮瓣中的新生小血管管壁內(nèi)密布胞核呈現(xiàn)綠色熒光，同時(shí)胞漿呈現(xiàn)紅色熒光的細(xì)胞，表明該細(xì)胞正是由BMSC分化而來的血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。所以，BMSC不僅通過分泌促進(jìn)血管出芽的VEGF等細(xì)胞因子發(fā)揮作用，同時(shí)還能通過分化為血管內(nèi)皮系細(xì)胞，形成原始血管網(wǎng)的血管新生，共同促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣內(nèi)的血管再生，促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣的成活。

本實(shí)驗(yàn)移植的BMSC為同種異體，但術(shù)后第7天進(jìn)行的冰凍切片追蹤觀察發(fā)現(xiàn)，移植到異體兔內(nèi)的BMSC均勻分布于皮下，保持了良好的生物活性，體現(xiàn)了BMSC不被異體排斥的免疫特性，其機(jī)理被認(rèn)為是BMSC表面只表達(dá)少量HLA2Ⅰ類抗原，不表達(dá)HLA2Ⅱ類抗原，以及通過旁分泌作用抑制B細(xì)胞和T細(xì)胞增殖，激活T細(xì)胞凋亡，從而形成免疫抑制。由于BMSC具有多種表面標(biāo)記物，且尚未篩選到其獨(dú)有的標(biāo)志分子，給鑒定帶來一定的困難，故我們選擇了 CD34、CD45、CD29、CD90 進(jìn)行檢測[12]。

總之，本研究證明，BMSC異體移植能促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣的成活，但細(xì)胞懸液的最恰當(dāng)濃度、用量、給藥途徑和給藥時(shí)點(diǎn)，以及促進(jìn)血管再生的更深入機(jī)制等都還有待進(jìn)一步研究。

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