自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植治療糖尿病下肢血管病變

李紅普 仝現(xiàn)州 史帥偉

近年來，糖尿病發(fā)病率呈上升趨勢，糖尿病周圍血管病變（Peripheral vascular disease，PVD）也越來越受到關(guān)注。PVD主要累及肢體中小動脈，病變廣泛，呈階段性進(jìn)展，最終造成嚴(yán)重的動脈血管狹窄、肢體缺血壞死，截肢（趾）率高，是糖尿病患者致殘的主要原因。PVD患者動脈遠(yuǎn)端血管閉塞或狹窄，血液循環(huán)差，常規(guī)藥物治療效果不明顯；且PVD屬多節(jié)段血管病變，多數(shù)患者無法進(jìn)行介入治療或血管搭橋手術(shù)。因此，通過細(xì)胞移植和基因治療等手段，重新激活或提高機(jī)體固有的血管再生能力，從而促進(jìn)側(cè)枝循環(huán)的形成，成為治療PVD的新策略。

1 對象與方法

1.1 病例資料

2007年5月至2008年11月，選取雙側(cè)下肢病變程度接近的糖尿病周圍血管病變患者30例（60條下肢），其中男18例，女12例，年齡60～78歲（平均69.5歲）。

1.2 操作方法

治療前，控制患者空腹血糖≤7.0 mmol/L，餐后2 h血糖≤10.0 mmol/L。取得所有患者及家屬的同意并簽署手術(shù)治療同意書。

選取患者左下肢作為實驗組，右側(cè)為對照組。術(shù)前3 d皮下注射人重組粒細(xì)胞集落刺激因子500 U/d，共3 d，同時給予低分子肝素預(yù)防血栓形成。第4天采集患者雙側(cè)髂骨骨髓100～200 mL，淋巴細(xì)胞分離液分離出單個核細(xì)胞，制成干細(xì)胞混懸液40～50 mL，高倍顯微鏡行有核細(xì)胞總數(shù)計數(shù)，流式細(xì)胞儀進(jìn)行CD34+細(xì)胞計數(shù)。治療前30 min口服鹽酸美施康定緩釋片10 mg鎮(zhèn)痛，嚴(yán)格無菌操作，在實驗側(cè)肢體沿動脈走向多點肌肉內(nèi)注射干細(xì)胞混懸液，按2 cm間距進(jìn)行缺血肢體肌肉注射，每點注射0.5～0.7 mL，進(jìn)針深度為1.5～2 cm，通常單側(cè)下肢注射50～60針。

1.3 療效觀察

治療后觀察15個月，對雙側(cè)下肢的膚色、肢體疼痛、冷感、潰瘍、皮溫改變及間歇性跛行進(jìn)行比較；實驗室檢查：數(shù)字減影動脈血管造影 （Digital subtraction arteriography，DSA）和肱踝指數(shù)（Ankle brachial pressure index，ABI）等進(jìn)行治療前后和雙側(cè)的對照評估。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行分析，實驗側(cè)治療前后、對照組一般治療前后采用配對t檢驗，治療組和對照組之間行兩獨立樣本t檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗側(cè)治療前后比較

實驗側(cè)治療后肢體冷感明顯減輕；疼痛評分明顯低于治療前；間歇性跛行評分明顯降低；無痛性行走距離明顯延長，按正常速度（50～80 m/min）步行，單次行走距離比治療前延長500～2 000 m（表1）。

2.2 實驗側(cè)和對照側(cè)比較

實驗側(cè)肢體冷感明顯減輕，疼痛評分明顯低于對照側(cè)，間歇性跛行評分較對照側(cè)明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表 2）。

表2 治療后兩組各項指標(biāo)治療后比較（s）Table 2 Comparison of the indicators in 2 groups after treatment

表2 治療后兩組各項指標(biāo)治療后比較（s）Table 2 Comparison of the indicators in 2 groups after treatment

P<0.05

指標(biāo) 實驗組(s)對照組(s)Indicator Exp group Ctrl group疼痛 1.73±0.96 3.02±0.65 Pain冷感 1.80±1.08 3.07±0.76 Cold sensation間歇性跛行(m)2.33±0.98 3.40±1.20 Claudication(m)皮溫(℃)33.25±0.87 31.50±0.64 Skin temperature(℃)

2.2.1 皮膚顏色和體毛

患肢治療前皮膚顏色暗紅、青紫或蒼白，實驗側(cè)經(jīng)BMSC移植后皮膚顏色逐漸變得光澤、紅潤；下肢水腫也顯著改善；原來下肢或足趾體毛脫落處有新生體毛出現(xiàn)且較前濃密；對照側(cè)無上述體征改變。

2.2.2 潰瘍

實驗側(cè)治療后，新鮮肉芽組織生長在潰瘍底部，癥狀逐漸減輕。對照組癥狀無顯著改善。

2.2.3 皮溫

實驗側(cè)治療后2 d內(nèi)皮膚溫度逐漸開始升高，并穩(wěn)定在正常范圍內(nèi)。而對照側(cè)肢體皮溫依然偏低，兩側(cè)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 DSA

治療后6個月，患者行雙側(cè)下肢DSA，實驗側(cè)可見豐富的側(cè)支血管形成，與治療前相比效果顯著（圖1）。對照組下肢血管造影較治療前無明顯變化。

圖1 治療組治療前后DSA顯示側(cè)枝血管生成情況Fig.1 Collateral angiogenesis showed in DSA before and after treatment

2.4 ABI

實驗側(cè)治療前ABI為0.35±0.20，治療后ABI為0.56±0.10，P<0.05。對照側(cè)治療前后ABI無顯著改變。

2.5 相關(guān)并發(fā)癥和不良反應(yīng)

BMSC移植過程中，患者無不適癥狀；移植24 h后可見實驗側(cè)肢體輕度腫脹，有脹感，4～8 d后腫脹消失；整個治療過程中，患者均未出現(xiàn)其它異常癥狀及體征，相關(guān)輔助檢查肝功能及腎功能無特殊改變，心電圖無異常，凝血酶原時間及血細(xì)胞分析正常。

3 討論

PVD是糖尿病發(fā)展到中晚期常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。PVD主要累及肢體中小動脈，病變廣泛，呈階段性進(jìn)展，最終造成嚴(yán)重的動脈血管狹窄、肢體缺血壞死。近心端病變發(fā)生后，由于遠(yuǎn)心端血流量減少，血流速度變慢，病程加快，造成嚴(yán)重的血管狹窄，遠(yuǎn)端微小動脈閉塞，難以進(jìn)行血管搭橋手術(shù)或血管腔內(nèi)治療，導(dǎo)致肢體遠(yuǎn)端嚴(yán)重的缺血性壞死，截肢（趾）率甚高，其高位截肢率高達(dá)20%以上[1]。部分患者由于心腦血管的疾病，不能耐受手術(shù)則會因壞死組織的吸收引發(fā)多器官功能衰竭而危及生命。目前，對于這些患者尚無有效的處理措施。因此，治療糖尿病周圍血管病變的新途徑是迫切需要解決的問題。

本世紀(jì)初，人們逐漸開始認(rèn)識到以患者固有的健康血管為基礎(chǔ)，通過某些方法促使血管新生，從而建立豐富的側(cè)枝循環(huán)是治療PVD等血管閉塞性疾病的最佳策略之一。本組患者的治療結(jié)果證實，以BMSC為基礎(chǔ)的細(xì)胞移植治療和以血管生長因子為基礎(chǔ)的重組分子藥物治療是達(dá)到上述目的的有效途徑，并通過補(bǔ)充間充質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量來增加血管生長因子的作用底物，從而達(dá)到增加血供，改善循環(huán)的效果。

既往實驗數(shù)據(jù)及結(jié)果確定，自體BMSC的治療機(jī)制主要是通過一系列途徑參與形成了血管新生和微循環(huán)的形成；動物實驗證實，自體BMSC植入缺血肢體后可促進(jìn)局部血管形成[2]。

3.1 自體BMSC的分離

前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，BMSC可在原始部位進(jìn)一步分化，然后趨化歸巢至病變部位[3]。因此，對PVD的治療應(yīng)重視骨髓單個核細(xì)胞在缺血部位的組織中原位分化歸巢。我們通過抽取患者骨髓，并在抽取的骨髓血標(biāo)本中加入淋巴細(xì)胞分離液，離心，吸取單個核細(xì)胞層進(jìn)行分離。經(jīng)過密度梯度離心分離細(xì)胞后，雖然淋巴細(xì)胞是最后的采集物，但富含干細(xì)胞成分的多細(xì)胞成分也被濃縮在其中。

3.2 自體BMSC移植

在操作前必須嚴(yán)格遵循知情同意原則，與患者及其家屬充分討論獲益與風(fēng)險評估情況；根據(jù)患者的不同情況，分離純化的干細(xì)胞可通過在下肢缺血部位的肌肉注射移植。大多數(shù)報道認(rèn)為，干細(xì)胞移植應(yīng)采用蛛網(wǎng)膜下腔阻滯或硬脊膜外腔阻滯麻醉；而我們根據(jù)以往的經(jīng)驗，采用常規(guī)肌肉注射，無需特殊麻醉，臨床結(jié)果提示治療操作中患者可以耐受并無特殊不適。

Hu等[4]的研究證實，血細(xì)胞中可分離純化出內(nèi)皮祖細(xì)胞。因此，我們可以將內(nèi)皮祖細(xì)胞動員至外周血液循環(huán)系統(tǒng)中，從而在相對缺血組織中誘導(dǎo)血管新生[5-7]。自體BMSC移植可使大多數(shù)患者的局部疼痛得到緩解。另外，PVD患者年齡一般偏大，部分患者既往就有不同程度的心血管及腦血管疾病，并且糖尿病患者本身血液黏滯性較高[8-9]，在移植前后，應(yīng)根據(jù)患者個體情況給予抗凝治療。

3.3 干細(xì)胞移植治療的安全性問題

干細(xì)胞移植過程中出現(xiàn)的免疫排斥反應(yīng)、致瘤、致突變作用、感染傳染病以及用粒細(xì)胞集落刺激因子行外周血動員過程中可能發(fā)生的心臟、腦血管栓塞等意外情況是干細(xì)胞移植治療過程中的主要問題。而自體骨髓干細(xì)胞移植不存在前3種安全隱患，并可通過抗凝治療來有效預(yù)防心腦血管栓塞等意外。谷涌泉等[10]對7例自體BMSC移植后最終卻未能避免截肢者的截肢標(biāo)本進(jìn)行了病理學(xué)檢查，在局部移植部位肌肉中未見有成骨現(xiàn)象和腫瘤生成征象。孫洪波等[11]對進(jìn)行自體BMSC移植的15例糖尿病下肢動脈閉塞癥患者術(shù)后進(jìn)行長期隨訪，結(jié)果顯示血漿VEGF及TGF-β1水平與動員前無顯著性差異，進(jìn)一步證明了自體BMSC移植及重組人粒細(xì)胞集落刺激因子動員是安全的。張軼斌等[12]觀察行自體BMSC移植患者86例，均行重組人粒細(xì)胞集落刺激因子干細(xì)胞動員，采集前白細(xì)胞數(shù)最低為22×109/L,最高為 63×109/L，其中發(fā)生心腦血管缺血性并發(fā)癥共4例，占4.65%，均為白細(xì)胞數(shù)上升至40×109/L以上時發(fā)生。由此可見，用重組人粒細(xì)胞集落刺激因子干細(xì)胞動員可出現(xiàn)白細(xì)胞增多或血液高凝狀態(tài)，二者有可能誘發(fā)心絞痛、心肌梗塞、腦梗塞或急性動脈血栓形成，建議在動員過程中酌量使用肝素抗凝。

3.4 自體BMSC移植治療的體會

干細(xì)胞治療后患肢的疼痛可以緩解，這顯然同血管的新生沒有關(guān)聯(lián)，究竟是何原因尚無確切的證據(jù)。我們認(rèn)為，在干細(xì)胞肌內(nèi)注射的過程中，針刺穴位可能是即時止痛的原因，還有待于循證。治療后除非存在肢體潰瘍而引起的壞疽，其余患者即可早日進(jìn)行適量運動，活動較早較多的患者肢體癥狀緩解較快。結(jié)合以往治療經(jīng)驗分析，其原因可能是因為缺血肢體血供得到了改善[13]，從而改善了骨髓單個核細(xì)胞的進(jìn)一步分化的環(huán)境，促進(jìn)了血管新生。PVD臨床治療是一個綜合性的治療，只有通過全方位治療，并有效地控制感染、監(jiān)測血糖水平，以達(dá)到足部動脈血液供應(yīng)改善，這是治療的關(guān)鍵[14]。自體BMSC移植治療PVD，通過建立側(cè)枝循環(huán)以達(dá)到改善足部動脈血液供應(yīng)。BMSC移植治療后如何進(jìn)一步合理處理及結(jié)合全面治療使效果達(dá)到最優(yōu)化，有待于進(jìn)一步探索。

我們對BMSC移植治療PVD進(jìn)行了初步的臨床嘗試，結(jié)果是安全有效的，有望成為一種新的治療方法。對于其中的機(jī)理和療效的優(yōu)化，尚有待于進(jìn)一步的研究。

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