蛋白激發(fā)子基因peaT1植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化棉花的研究*

唐宏琨, 曾洪梅, 楊秀芬, 袁京京, 邱德文

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,農(nóng)業(yè)部生物防治重點(diǎn)開放實驗室,北京 100081)

自1987年Umbeck首次報道通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[1],將卡那霉素抗性基因轉(zhuǎn)入棉花以來,棉花轉(zhuǎn)基因研究迅速發(fā)展。國內(nèi)外利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已將抗蟲、抗除草劑等有價值的目的基因?qū)朊藁?得到了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因棉花。我國農(nóng)業(yè)部于1997年批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因棉花的商業(yè)化種植,至2007年轉(zhuǎn)基因棉花已占棉花種植面積的60%以上,產(chǎn)生了顯著的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會效益。

蛋白激發(fā)子是一類能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)的信號分子,在植物與病原菌的相互識別中起重要作用。其對病原菌無直接毒殺作用,通過信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生乙烯、水楊酸、吲哚乙酸、茉莉酸、植保素和病程相關(guān)蛋白等[2-3],調(diào)節(jié)植物的新陳代謝,激活植物的免疫系統(tǒng),從而促進(jìn)植物生長、增強(qiáng)植物抵抗病原菌的能力,有效防止或減輕病害的發(fā)生。peaT1是本實驗室從極細(xì)鏈格孢(Alternaria tenuissima)中分離出來的蛋白激發(fā)子,具有誘導(dǎo)多種植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性、促進(jìn)植物生長、改善作物品質(zhì)等作用[4-6]。peaT1的編碼基因已被克隆(GenBank登錄號為EF030819),在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達(dá)蛋白仍具有誘導(dǎo)植物抗旱、促進(jìn)根系生長等生物活性[7-8]。

關(guān)于蛋白激發(fā)子轉(zhuǎn)基因植物的研究目前已有報道,并展現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。Qiu[9]等將蛋白激發(fā)子基因pemG1轉(zhuǎn)化水稻和煙草,轉(zhuǎn)基因作物表現(xiàn)出較好的抗病性。邵敏等[10]將來自水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzae)的hr f AXoo基因轉(zhuǎn)化水稻,轉(zhuǎn)基因株系中水稻白葉枯病菌的生長明顯受到抑制。蔣冬花等[11]將隱地蛋白突變基因CryK 13V整合到煙草基因組中,結(jié)果表明轉(zhuǎn)化植株的相關(guān)抗病性均有提高。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法開展激發(fā)子基因peaT1的轉(zhuǎn)基因棉花研究,建立了有效的轉(zhuǎn)基因植株再生體系,獲得了再生苗及大量的胚狀體,為進(jìn)一步培育抗病蟲、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的棉花品種提供了基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

蛋白激發(fā)子基因 peaT1由本實驗室從極細(xì)鏈格孢菌克隆獲得,質(zhì)粒pET28a-peaT1由本實驗室保存;植物表達(dá)載體 pCAMBIA 2300和農(nóng)桿菌LBA 4404由本實驗室保存;中間載體pG4AS-cup由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所郭三堆研究員惠贈;受體棉花品種‘中棉 24’(‘CCRI24’)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花科學(xué)研究所提供。

ExTaq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、DNA Marker、pMD18-T Simple載體和DNA 片段回收試劑盒均購自大連TaKaRa公司,大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 和反轉(zhuǎn)錄試劑盒 EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司,質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司,柱式植物RNAout試劑盒購自天恩澤生物公司,所用引物由英駿生物技術(shù)有限公司(Invitrogen)合成。卡那霉素和羧芐青霉素購自AMRESCO公司,其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計含有 PstⅠ和 XhoⅠ酶切位點(diǎn)的引物primer1(TACTGCAGATGGCCAACCCCCGCATTGAAGAG)和p rimer2(CGCTCGAGCTA TATGCTCAGCGCCATGATGGA),以質(zhì)粒 pET28apeaT1為模板擴(kuò)增peaT1序列,引入PstⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。將PCR產(chǎn)物回收后連接pMD 18-T Simp le載體,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后提取質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒和中間載體pG4AS-cup分別用PstⅠ和XhoⅠ雙酶切,連接含有目的基因pea T1的小片段和中間載體片段,得到重組載體pG4AS-peaT1。將重組載體pG4AS-peaT1和pCAMBIA 2300分別用Eco RⅠ和 H in dⅢ雙酶切,回收目的片段經(jīng)T4 DNA酶連接構(gòu)成植物表達(dá)載體pCAMBIA 2300-peaT1。構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pCAMBIA 2300-peaT1熱激法轉(zhuǎn)化DH 5α感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒用PstⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定目的基因peaT1是否正確插入。采用凍融法將酶切鑒定的植物表達(dá)載體pCAMBIA 2300-peaT1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA 4404菌株。

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化CCRI24

1.3.1 菌株培養(yǎng)及無菌苗制備

挑取含有目的基因和選擇標(biāo)記基因的單菌落,接種于含50 mg/L卡那霉素和50 mg/L鏈霉素的YEB液體培養(yǎng)基中,28℃振蕩過夜暗培養(yǎng)至對數(shù)生長期。用YEB液體培養(yǎng)基稀釋菌液,再振蕩培養(yǎng)4～6 h,至 A600值為0.5備用?！瓹CRI24’棉花種子用硫酸脫絨后,自來水洗掉種子表面硫酸并晾干。70%乙醇表面消毒種子1Min,棄去乙醇,無菌水漂洗。再用0.1%的H gCl2表面消毒30 min,無菌水漂洗4次,種于1/2MS培養(yǎng)基上,28℃,2 000 lx光照培養(yǎng)7 d備用。

1.3.2 共培養(yǎng)

選取發(fā)育良好的無菌苗,將其下胚軸切成5～8mm長的莖段,浸泡在預(yù)先培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液中。15min后取出,放置在鋪有一層濾紙的含有2,4-D、KT和 IAA的 MS培養(yǎng)基上,21℃共培養(yǎng)48 h,然后轉(zhuǎn)移到含有50mg/L卡那霉素、500Mg/L羧芐青霉素的上述培養(yǎng)基上,28℃、2 000 lx、每天光照14 h培養(yǎng)(以下培養(yǎng)條件相同),通過調(diào)整激素的濃度以誘導(dǎo)抗性愈傷組織[12-13]。

1.3.3 胚性愈傷及胚狀體的誘導(dǎo)

將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(MS+0.01mg/L 2,4-D+0.01mg/LKT+0.01mg/L IAA),45 d左右繼代1次。將米黃色的顆粒狀胚性愈傷轉(zhuǎn)移到胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(MS-NH4NO3+KNO3加倍+無激素+Gln 1.0 g/L+Asn 0.5 g/L+活性炭1.0 g/L+AgNO3 40mg/L),30 d繼代一次直到出現(xiàn)胚狀體[14-15]。

1.3.4 再生苗的培養(yǎng)及嫁接

將誘導(dǎo)出的胚狀體轉(zhuǎn)移到再生苗培養(yǎng)基上(MS+IAA 0.1 mg/L+6-BA 0.1 mg/L+G ln 1.0 g/L+Asn 0.5 g/L+活性炭1.0 g/L+AgNO3 40 mg/L),30 d左右繼代一次。在裝有營養(yǎng)土的土缽中種上普通棉花種子,待子葉完全展開時用作砧木苗。劈接法將再生棉株嫁接到砧木苗上,澆少量水后用透光塑料袋密封嫁接苗,25℃培養(yǎng)7 d左右,慢慢透氣煉苗2～3 d即可移栽溫室。

1.4 再生苗的分子檢測

1.4.1 再生苗的PCR分析

取幼嫩再生棉花葉片,參照CTAB法提取總DNA,用 p rimer1和p rimer2進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,驗證外源基因的整合情況。

1.4.2 再生苗的southern blot分析

CTAB法提取再生棉株2和4及PCR檢測呈陰性的再生苗基因組DNA,用Eco RⅠ充分酶切基因組DNA約16 h,40 V電壓下以0.8%瓊脂糖凝膠(不加染料)電泳10～12 h,成像后切掉凝膠邊角作為標(biāo)記。參照Southern的方法[16],并結(jié)合DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ(Roche)說明書,對經(jīng)PCR檢測呈陽性的再生苗進(jìn)行southern blot分析,以質(zhì)粒 pCAMBIA-2300-peaT1作為陽性對照,PCR檢測呈陰性的再生苗為陰性對照。

1.4.3 再生苗的RT-PCR分析

參照天恩澤柱式植物RNAout試劑盒方法,提取經(jīng)PCR檢測呈陽性棉花植株葉片總RNA,參照全式金EasyScrip t First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒合成cDNA,進(jìn)行RT-PCR分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

從轉(zhuǎn)化pCAMBIA 2300-peaT1的大腸桿菌DH 5α中提取質(zhì)粒,用PstⅠ和XhoⅠ雙酶切,如圖1所示,酶切所得片段大小與理論值624 bp一致,說明pea T1插入預(yù)期位點(diǎn),載體構(gòu)建成功,該載體含有加倍增強(qiáng)子元件、和Kozak序列及多聯(lián)終止密碼子序列的表達(dá)盒,可以增強(qiáng)目的基因的表達(dá)[17]。

圖1 重組質(zhì)粒酶切鑒定

2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化CCRI24

2.2.1 抗性愈傷的誘導(dǎo)

經(jīng)共培養(yǎng)的無菌苗下胚軸切段轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織,抗性愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖受激素種類和濃度影響比較大。如表1所示,當(dāng)只有KT、IAA時,愈傷組織生長緩慢,外植體長根多,只有KT、2,4-D時,愈傷生長快,愈傷多呈綠色硬塊狀不利于分化。只有2,4-D和IAA時,愈傷表面多呈白色霜狀堅硬狀態(tài),不易分化。3種激素濃度均為0.1mg/L時,愈傷組織生長速度不是很快,多呈黃白色疏松狀態(tài),有利于進(jìn)一步分化成胚性愈傷。

表1 激素對抗性愈傷誘導(dǎo)的影響

2.2.2 胚性愈傷及胚狀體的形成

將灰白色疏松的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,繼代2～3次,可分化出米黃色的顆粒狀胚性愈傷組織,將其轉(zhuǎn)移到胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,繼代1～2次,誘導(dǎo)出了大量不同形態(tài)的胚狀體細(xì)胞,根據(jù)其形態(tài)和生長時期分為球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚。

2.2.3 轉(zhuǎn)化苗的再生及嫁接

挑選子葉胚在成苗培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)2～3次,可誘導(dǎo)出再生苗,如圖2所示。由于棉花組織培養(yǎng)生根比較困難,直接移栽成活率較低,本研究采用劈接法嫁接再生苗。將4棵長出4～5片葉的再生苗嫁接到準(zhǔn)備好的砧木上,保濕7 d左右,緩慢透氣煉苗3 d移栽溫室培養(yǎng)。

圖2 棉花轉(zhuǎn)化苗的再生

2.3 再生苗的分子檢測

2.3.1 再生苗的PCR分析

以CTAB法提取的4棵再生苗的總DNA為模板,用引物primer1和primer2進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果如圖3所示。PCR檢測結(jié)果初步表明,目的基因peaT1已經(jīng)整合到再生棉株2和4的基因組當(dāng)中。

圖3 棉花再生苗的PCR檢測

2.3.2 再生苗的southern blot分析

從再生棉株2和4及PCR檢測呈陰性的再生苗中提取DNA,進(jìn)行southern雜交分析,如圖4所示,質(zhì)粒陽性對照及再生苗2和4均檢測到雜交條帶,其中再生苗4中目的基因為雙拷貝插入,陰性對照沒有雜交信號,表明目的基因peaT1已經(jīng)整合到再生苗2和4基因組當(dāng)中。

圖4 棉花再生苗的southern blot分析

2.3.3 再生苗的RT-PCR分析

從PCR陽性株的葉片中提取總 RNA,以合成cDNA第1鏈為模板,primer1和primer2的PCR結(jié)果如圖5所示,再生棉苗2和4均擴(kuò)增到和陽性對照大小一致的條帶,空白對照則沒有目的條帶,表明目的基因peaT1已經(jīng)整合到再生苗2和4當(dāng)中,并成功轉(zhuǎn)錄。

圖5 再生苗的RT-PCR分析

3 討論

棉花的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化已經(jīng)開展多年,并在許多品種上取得了成功。與其他作物相比,棉花組織培養(yǎng)受基因型限制,周期較長,體細(xì)胞胚胎發(fā)生困難等限制了其廣泛應(yīng)用[18]。組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)出的胚性愈傷,在初次繼代及隨后胚狀體誘導(dǎo)過程中會出現(xiàn)嚴(yán)重的褐化現(xiàn)象,導(dǎo)致胚性愈傷死亡。本研究中胚性愈傷繼代時多伴有褐化現(xiàn)象,在培養(yǎng)基中添加活性炭和硝酸銀一定程度上降低了褐化程度,需要進(jìn)一步嘗試更有效的辦法避免或減輕褐化,以提高植株的再生率。針對棉花組織培養(yǎng)生根困難的問題,目前多采用嫁接法以縮短再生周期,保證再生苗的成活率。本研究采用劈接法嫁接再生苗,需要注意的是：嫁接過程中溫度應(yīng)控制在23～25℃[19],嫁接后澆水不宜過多,否則會引起砧木苗與土壤接觸部分褐腐死亡,緩慢透氣使幼嫩棉苗不易失水太快而引起萎蔫死亡,能保證嫁接苗的成活。

蛋白激發(fā)子pea T1是通過誘導(dǎo)植物自身免疫,達(dá)到抗病促生的作用,其不針對某一種或某一類病害,不會產(chǎn)生抗藥性,對環(huán)境安全,應(yīng)用前景廣闊[20]。蛋白激發(fā)子基因pea T1與植物基因工程技術(shù)的廣泛結(jié)合,將為培育具有廣譜抗性的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種拓展更廣闊的空間。

本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,以棉花品種‘CCRI24’為受體材料,成功轉(zhuǎn)化peaT1基因并得到再生苗,經(jīng)分子生物學(xué)方法檢測peaT1已經(jīng)整合到棉花基因組當(dāng)中,為開展激發(fā)子基因peaT1轉(zhuǎn)化棉花的研究提供了基礎(chǔ)材料。轉(zhuǎn)peaT1基因的棉花能否產(chǎn)生對相關(guān)病害的抗性、表現(xiàn)出促進(jìn)生長的功能,還需要進(jìn)一步驗證激發(fā)子基因peaT1在‘CCRI24’中的表達(dá),綜合分析轉(zhuǎn)基因棉花的農(nóng)藝性狀、抗病性,期望能從轉(zhuǎn)基因棉花后代中篩選到優(yōu)良品種。

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