枸杞多糖對人卵巢癌裸鼠IGF-Ⅰ、IGFR、IGFBP-1水平干預作用的研究

韋 敏，鄭生智，馬 紅，呂 曄

（1.中國科學院江蘇省植物研究所，江蘇 南京210014；2.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京210029）

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器三大惡性腫瘤之一，其病死率為婦科腫瘤之首，嚴重威脅著婦女的健康和生命安全。對卵巢癌的診治中醫(yī)學雖積累了一定的經(jīng)驗，但還未見枸杞子及其成分對其治療的研究。枸杞子為茄科植物寧夏枸杞(Lycium Barbarum L.)的干燥成熟果實，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，一直被用為強身健體之補藥。枸杞子含有枸杞多糖、多種氨基酸、微量元素、維生素、牛磺酸、生物堿、揮發(fā)油等化學成分。一般認為，枸杞多糖(Lycium Barbarum Polysaccharides，LBP)為 其 活性成分?，F(xiàn)代藥理學研究證明枸杞多糖能改善性功能、抗衰老、增強機體免疫力、抗腫瘤、降血脂、降血糖、抗疲勞等[1-7]，臨床廣泛用于降低血脂血糖、保肝、抗腫瘤、抗衰老等。建立人癌裸鼠模型是研究人類腫瘤生物學行為和抗腫瘤治療的重要基礎方法之一。本研究觀察枸杞多糖對人卵巢癌裸鼠干預后的IGF家族中部分指標的變化以期了解枸杞多糖對卵巢癌的作用機制。現(xiàn)將實驗方法及結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 BALB/c，nu/nu裸小鼠，4～6周齡，雌性，40只體質(zhì)量18～20 g，由南京大學模式動物研究所提供，無特定病原體（specific pathogen free，SPE）條件下飼養(yǎng)，合格證號：SCXK(滬)2007-0005號。人卵巢癌細胞株SK-OV-3購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 藥物 枸杞多糖（40%）購買于上?？抵壅婢嗵怯邢薰?，人體推薦攝入量132 mg/（人·d），即2.2 mg/（kg·d）。

1.1.3 試劑 美國ADL goat anti-rat Total Insulin Growth Factor 1 Elisa測定試劑盒 (No.QRCT-3013331110331EIAUTL)，美國ADL goat anti-rat Insulin like Growth Factor Receptor Elisa測定試劑盒 (No.QRCT-301110202331EIAUTL)， 美 國ADL goat anti-rat Total Insulin like Growth Factor Binding Protein 1 Elisa測定試劑盒 (No.QRCT-3013321332202EIAUTL)由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.4 儀器 Labsystems Finnpipette 100μL單道移液器；Thermo 50μL 8道移液器；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；華東電子DG5033A酶標儀（南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 卵巢癌細胞株SK-OV-3，常規(guī)方法復蘇，接種于含10%小牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)液(10.2 g PRMI 1640細胞培養(yǎng)基加入800 mL雙蒸水中，攪拌至完全溶解，然后加入NaHCO32 g，再加雙蒸水定容至1 000 mL，0.22μm微孔濾膜除菌，分裝后4℃存放。用前調(diào)pH值，加入加熱滅活的小牛血清至終濃度為10%，加入青鏈霉素使其終濃度分別為100μg/mL)，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，細胞長滿單層后用0.25%胰蛋白酶(先將4 g胰酶加入100 mL 0.02%EDTA配成濃度為4%儲存液，過濾除菌，4℃存放。然后用高壓滅菌的1×PBS 40倍稀釋)消化傳代，大量擴增細胞，當細胞總數(shù)達到要求時，取對數(shù)生長期細胞，以胰酶消化，PBS液洗滌2次，低速離心800 r/min，15 min，制成1×107個/mL細胞懸液備用。

1.2.2 腫瘤模型的制備 由于卵巢癌復發(fā)病灶主要位于盆腹腔，故可以利用卵巢癌細胞腹腔種植于BABL/c雌性裸鼠建立荷人卵巢癌裸鼠腹腔種植瘤模型。取4～6周的BABL/c雌性裸鼠，體質(zhì)量(18.2±1.6)g，腹腔內(nèi)注射含卵巢癌細胞的NS，注射后每日稱體質(zhì)量，對因腫瘤致死的裸鼠，進行腹膜、心、肝、脾、腎、肺、腸、卵巢、子宮、橫膈和網(wǎng)膜的組織學檢查，證實其致癌性，提示造模是成功的。

1.2.3 給藥方法及分組 隨機取4～6周的BABL/c雌性裸鼠8只作空白組。32只取腹腔內(nèi)注射1×107卵巢癌細胞4周后的BABL/c雌性裸鼠隨機分為共4組，模型組灌服生理鹽水、枸杞多糖高、中、低劑量組分別為30、20、10 mg/kg；給藥劑量均按成人每日60 kg體表面積換算（以下簡稱高、中、低3個劑量組、空白組和模型組）。分別稱取樣品50、100、150 mg加純凈水至100 mL配制成3個不同濃度受試物（隔日配制），空白組和模型組給予純凈水，各組每日以20 mL/kg灌胃，連續(xù)30 d。

1.2.4 IGFBP-1、IGFR的測定 給予受試物結(jié)束后，禁食12 h，處死動物取血清冷凍于-20℃，用于測定血清IGF-Ⅰ水平（由于血清量少，IGFR水平無法測定），同時快速取出卵巢組織速凍于液氮中，用于測定IGFBP-1和IGFR水平。

1.2.5 血清胰島素樣生長因子1（IGF-Ⅰ）測定 直接取血清100μL，嚴格按照試劑盒的說明進行操作。1.2.6 裸鼠卵巢組織蛋白含量的測定(考馬斯亮蘭法) 準確稱取組織質(zhì)量，每個樣本加入300μL的生理鹽水在冰浴中勻漿5 min，2 500 r/min，離心10 min，取上清液再用生理鹽水稀釋按照1∶4的組織勻漿待測。按照試劑盒的說明進行操作，于595 nm波長測OD值。

1.2.7 卵巢組織中胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1（IGFBP-1）測定 準確稱取組織質(zhì)量，每個樣本加入300μL的生理鹽水在冰浴中勻漿5 min，2 500 r/min，離心10 min，取上清液組織勻漿待測。嚴格按照試劑盒的說明進行操作。

1.2.8 卵巢組織中胰島素樣生長因子受體（IGFR）測定 準確稱取組織質(zhì)量，每個樣本加入300μL的生理鹽水在冰浴中勻漿5 min，2 500 r/min，離心10 min，取上清液組織勻漿待測。嚴格按照試劑盒的說明進行操作。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 8.0軟件t檢驗法進行統(tǒng)計學分析，以“±s”表示。

2 結(jié)果

2.1 枸杞多糖對人卵巢癌裸鼠血清IGF-Ⅰ水平的影響

模型組血清中IGF-Ⅰ水平提示與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示造模成功。高、中、低3個劑量的枸杞多糖能降低腫瘤引起的IGF-Ⅰ水平的升高，與空白組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 枸杞多糖對人卵巢癌裸鼠血清IGF-Ⅰ水平的影響 （±s，n=8）

表1 枸杞多糖對人卵巢癌裸鼠血清IGF-Ⅰ水平的影響 （±s，n=8）

注：與模型組比較*P＜0.01；與空白組比較ΔP＜0.01。下同。

組 別空白組模型組高劑量組中劑量組低劑量組劑量(mg/kg)--30 20 10 IGF-Ⅰ（ng/mL）220.082 4±11.401 7 290.231 8±12.179 4Δ 247.341 1±10.034 6*251.435 6±13.598 1*264.121 6±11.255 3*

2.2 枸杞多糖對人卵巢癌裸鼠卵巢組織IGFBP-1和IGF-ⅠR水平的影響

模型組卵巢組織中IGFBP-1及IGFR水平均顯示與空白組有極顯著性差異（P＜0.01），提示造模成功。高、中、低3個劑量的枸杞多糖能升高由于腫瘤引起的IGFBP-1表達的下調(diào)，與空白組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），高、中劑量組枸杞多糖與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），低劑量組枸杞多糖與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高、中、低3個劑量的枸杞多糖能降低腫瘤引起的IGFR水平的升高，與空白組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義 （P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 枸杞多糖對人卵巢癌裸鼠卵巢組織IGFBP-1和IGFR水平的影響 （±s，n=8）

表2 枸杞多糖對人卵巢癌裸鼠卵巢組織IGFBP-1和IGFR水平的影響 （±s，n=8）

組 別空白組模型組高劑量組中劑量組低劑量組劑量(mg/kg)--30 20 10 IGFBP-1（ng/mg）27.722 3±2.390 9 11.162 0±1.387 7Δ 15.213 4±1.342 1*17.006 7±3.076 1*16.579 7±1.389 9*IGFR（ng/mg）6.944 3±0.938 6 13.025 6±0.561 9Δ 7.205 8±0.221 7*7.633 0±0.566 7*7.488 9±0.432 6*

3 討論

IGF家族對調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡有著重要作用，IGF系統(tǒng)包括2個多肽類生長因子（IGF-Ⅰ、IGF-ⅠI）、兩類受體（IGF-ⅠR、IGF-ⅠIR）、IGF高親和力的IGFBP1-6以及新發(fā)現(xiàn)的至少9種低親和力的IGFBP相關(guān)蛋白（IGFBP-rPs）、IGFBP蛋白酶及其他幾個與IGFBP相互作用的分子[8]。

IGF-Ⅰ是含70個氨基酸的多肽，在正常細胞和腫瘤細胞中均具有強有絲分裂活性。除了刺激細胞增殖以外，它還能抑制細胞凋亡，從而促進細胞的生長。這些活性均通過與其特異性受體(IGFR)結(jié)合而發(fā)揮作用。血清IGF-Ⅰ的增高為腫瘤表型的一部分，大多數(shù)腫瘤都需要IGF-Ⅰ來維持其增殖和生長[9]，這也和本實驗結(jié)果相吻合。本實驗顯示腫瘤模型組相比較空白組血清IGF-Ⅰ水平有顯著性升高，可見IGF-Ⅰ通過腫瘤細胞自分泌或旁分泌的產(chǎn)生，促進腫瘤細胞分化、生長。

IGF-ⅠR與細胞生長分化、胚胎發(fā)育有關(guān)，導致細胞向惡性表型轉(zhuǎn)化，導致腫瘤的形成和生長。本實驗顯示腫瘤模型組IGF-ⅠR水平上升與此理論吻合，故若能下調(diào)IGF-ⅠR可抑制腫瘤細胞惡性轉(zhuǎn)化，并可致細胞凋亡。

還未有研究考察腫瘤模型中IGFBP-1水平，本課題組考慮IGF結(jié)合蛋白中IGFBP-1具有特殊作用，不僅能與IGF-Ⅰ結(jié)合，控制IGF-Ⅰ運輸、代謝及分布，還能間接地調(diào)節(jié)葡萄糖及胰島素水平，并具有獨立于IGF之外針對血管平滑肌及生殖系統(tǒng)的作用，故考察了IGFBP-1水平。本研究結(jié)果IGFBP-1作為生長抑制因子，其在腫瘤模型中出現(xiàn)水平的下調(diào)。

不同劑量的枸杞多糖能明顯升高卵巢組織中IGFBP-1水平，降低IGF-Ⅰ和IGFR水平，提示枸杞多糖通過抑制腫瘤細胞惡性轉(zhuǎn)化來積極對抗卵巢癌，但具體作用機制和IGFBP-1在卵巢組織中的作用尚需進一步研究。

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