電穿孔法提高惡性瘧疾DNA疫苗免疫原性

吳 巍 藺亞暉 馬瑞森 席玨敏 王 恒

(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院，北京 100005)

引言

瘧疾是當今世界對人類危害最為嚴重的傳染性疾病之一。全球每年約有3.5億人感染惡性瘧疾，有100～150萬人因這一疾病而死亡，其中大多數(shù)為非洲撒哈拉以南地區(qū)5歲以下的兒童［1］。控制瘧疾的方法包括控制傳播媒介，提高診斷率和治療效果，采取疫苗預防等。目前，如何增強疫苗在人體內(nèi)的免疫效果是疫苗研究過程中的一個關鍵問題。

有效的紅內(nèi)期瘧疾疫苗能夠抑制裂殖子侵入紅細胞，降低瘧原蟲密度，從而減少發(fā)病率和死亡率。本課題組對紅內(nèi)期多表位疫苗的研制進行了長期的探索，前期工作借鑒了分子育種技術的隨機重組原理，利用表位改組技術構建了多表位基因庫，并用庫免疫血清篩選出高抗原性的陽性克隆，發(fā)現(xiàn)其中M.RCAg-1基因克隆不僅能在小鼠模型誘導交叉免疫保護而且能在家兔模型中誘導抗惡性瘧原蟲抑制性抗體［2］;D10抗原也能在家兔模型中誘導抗惡性瘧原蟲抑制性抗體［3］。由于以上基因均需通過表達重組蛋白后免疫，提高了疫苗的制備和保存成本，而此前在嘗試應用核酸疫苗免疫的研究中，通過肌肉注射的免疫途徑誘導產(chǎn)生的抗體水平較低，抗血清對瘧原蟲生長抑制作用也不明顯，因此需要選擇新的免疫途徑。

體內(nèi)電穿孔作為一種有效的DNA疫苗遞送途徑，可以顯著地增強DNA疫苗在動物體內(nèi)的免疫效果。在電場的作用下，細胞膜上瞬間打開一個“孔”，能夠提高目的基因進入細胞內(nèi)的概率，從而提高表達效率。電穿孔導致的輕微組織損傷還可以誘導產(chǎn)生炎性細胞因子和淋巴細胞浸潤，從而提高抗原遞呈，增強機體的免疫應答［4－6］。本試驗采用電穿孔途徑，在動物模型中觀察 M.RCAg－1和D10作為核酸疫苗的免疫原性及D10基因抗血清對瘧原蟲生長的體外抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、工具酶和試劑

6周齡的BALB/c小鼠、新西蘭大白兔(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所提供)，限制性內(nèi)切酶、Pfu DNA聚合酶等分子克隆工具酶(Takara公司，日本)，大量質(zhì)?？焖俪樘峒兓崛≡噭┖?Qiagen公司，德國)，真核表達載體 pVAX1(Invitrogen公司，美國)，辣根酶標記山羊抗小鼠IgG、FITC偶聯(lián)山羊抗鼠 IgG、封閉用羊血清原液和DAPI(北京中杉金橋生物公司)。

1.2 VR1012-M.RCAg-1 、pVAX1-M.RCAg-1、VR1012-D10、pVAX1-D10質(zhì)粒的構建及制備

用PCR擴增法分別從pDS-exM.RCAg-1和pET30a-D10(該兩個質(zhì)粒為本研究室保存)中擴增M.RCAg-1和D10 cDNA片段，并用定向克隆法分別亞克隆入真核表達載體 VR1012、pVAX1中。經(jīng)酶切分析和DNA測序證實克隆成功。

按無內(nèi)毒素的Qiagen Mega 22500供應商的操作說明書分別制備 VR1012、pVAX1、VR1012-M.RCAg-1 、pVAX1-M.RCAg-1、VR1012-D10、pVAX1-D10的質(zhì)粒。DNA的純度260/280 A值均為1∶1.85～1.90。分別溶于0.9% 的無菌生理鹽水中，－20℃保存待用。

1.3 電穿孔免疫

將實驗動物隨機分組，BALB/c小鼠每組5只，新西蘭大白兔每組2只，通過CELLECTRA?電穿孔裝置免疫。首先分別在動物后腿外側肌肉注射20 μL(小鼠)和50 μL(兔子)質(zhì)粒，分別采用三針式電極(小鼠)和六針式電極(兔子)，電極針插入肌肉，覆蓋注射點，參數(shù)為:兩個方波脈沖，恒流電流分別為0.1 A(小鼠)和0.5A(兔子)，持續(xù)52 ms，間隔時間為 1 s［7］。在第 0、2、4 周免疫，共 3 次。免疫前和每次免疫后的兩周取血，檢測特異性抗體滴度。

1.4 ELISA法檢測免疫小鼠特異性抗體水平

免疫小鼠血清中特異性抗體采用間接ELISA法檢測，包被抗原為 pDS-exM.RCAg-1和 pET30a-D10重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達的重組蛋白M.RCAg-1和D10。3%BSA封閉后加入適當稀釋的小鼠血清孵育，洗板后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體孵育，洗板后加底物顯色，在酶標儀450 nm測量各孔A值。

1.5 間接免疫熒光(IFA)分析基因免疫小鼠血清對天然蟲抗原的識別情況

將惡性瘧原蟲3D7株紅內(nèi)期混合期細胞均勻涂片并固定，加入適當稀釋的血清孵育，洗滌后加入FITC標記的羊抗鼠抗體孵育，再洗滌后加封片劑和DAPI后在熒光顯微鏡下觀察結果。IFA滴度的判定為陽性結果中血清的最高稀釋度。

1.6 兔血清IgG的純化

在免疫前和免疫后的第6周收集兔血清，按照蛋白A柱說明書親合層析純化兔血清的總IgG。用PBS透析后用于體外生長抑制試驗。

1.7 體外生長抑制(GIA)

用山梨醇將惡性瘧原蟲3D7蟲株環(huán)狀體期細胞同步化兩次。用正常人血細胞和完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)感染紅細胞至4%懸液，分裝于96孔板內(nèi)，120 μL/孔;分別加入過濾無菌含不同濃度純化抗體，每個濃度3個復孔，每孔30 μL;37℃正常蠟燭缸中培養(yǎng)48 h后，涂片，用Giemsa染色，鏡檢，計數(shù)3 000個細胞。生長抑制率按下列公式計［2］:

生長抑制率=［(對照組感染率－起始感染率)－(實驗組感染率 －起始感染率)］/(對照組感染率－起始感染率)×100%。

1.8 統(tǒng)計學方法

應用 t檢驗法檢測各組間的差異，顯著差異水平為 P<0.05。

2 結果

2.1 免疫小鼠血清中特異性抗體測定

用 30 μg/鼠 的 重 組 質(zhì) 粒 VR1012、pVAX1、VR1012-M.RCAg-1 、pVAX1-M.RCAg-1、VR1012-D10、pVAX1-D10分別經(jīng)電穿孔技術免疫 BALB/c小鼠，于免疫后2、4、6周采血，分離血清，用 ELISA法檢測血清的抗體滴度?？乖蛎庖呓M小鼠產(chǎn)生重組蛋白抗體，而載體對照組小鼠血清呈陰性反應。在連續(xù)接種過程中，血清抗體水平隨接種次數(shù)而升高，于第3次免疫后達到最高水平。VR1012-M.RCAg-1和pVAX1-M.RCAg-1免疫組誘導出小鼠的抗體平均滴度均為1/102 400(見圖1)。VR1012-D10免疫組誘導出小鼠的抗體平均滴度為1/51 200，而 pVAX1-D10免疫組為1/102 400，兩組相比有顯著性差異(P<0.01)(見圖2)。

圖1 惡性瘧原蟲多表位DNA疫苗M.RCAg-1接種BALB/c小鼠誘導產(chǎn)生的抗體Fig. 1 Antibody responses in BALB/c mice immunizedwithmulti-epitopeDNA vaccineM.RCAg-1 of Plasmodium falciparum

圖2 惡性瘧原蟲多表位DNA疫苗D10接種BALB/c小鼠誘導產(chǎn)生的抗體Fig.2 Antibody responsesin BALB/cmice immunized with multi-epitope DNA vaccine D10 of Plasmodium falciparum

2.2 基因疫苗誘導血清特異性抗體對天然蟲抗原的識別情況

經(jīng)30 μg/鼠抗原基因免疫BALB/c小鼠3次后收集血清，用間接免疫熒光法分析各組小鼠血清對天然蟲抗原的識別情況。結果顯示抗血清均能識別惡性瘧3D7株感染紅細胞，VR1012-M.RCAg-1、pVAX1-M.RCAg-1組最高稀釋滴度達1/40。VR1012-D10組最高稀釋滴度達1/800，pVAX1-D10組達1/1 600。

2.3 不同免疫劑量的基因疫苗誘導血清特異性抗體測定

分別 用 10、30、100 μg/鼠 劑 量 的 pVAX1-M.RCAg-1和pVAX1-D10基因疫苗免疫小鼠3次后收集血清，檢測血清特異性抗體水平。發(fā)現(xiàn)低、中、高劑量均能誘發(fā)特異性抗體產(chǎn)生，其中以低、中劑量組產(chǎn)生的抗體水平較高劑量組高，在低劑量和中劑量的免疫組誘導出小鼠的抗體滴度均為1/102 400，而高劑量組為1/51 200(見圖3和圖4)。兩組相比有顯著性差異(P<0.01)。

2.4 D10基因免疫兔純化IgG體外對瘧原蟲生長的影響

用50 μg pVAX1-D10質(zhì)粒免疫大白兔，免疫3次后收集血清，檢測抗體滴度為1/102 400，純化總IgG后體外檢測IgG對3D7蟲株生長的影響，發(fā)現(xiàn)在IgG濃度為2 mg/mL時對3D7的抑制率為45%，而且這種抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴關系(見表1)。

3 討論

圖3 不同劑量基因疫苗M.RCAg-1接種BALB/c小鼠誘導產(chǎn)生的抗體 (橫坐標中的L、M 和H分別代表低劑量、中等劑量和高劑量)Fig.3 Antibody responsesin BALB/cmice immunized with differentimmunedosesofM.RCAg-1 DNA vaccine(L，M and H represent lowdose、 middle-dose and high-dose group，respectively)

圖4 不同劑量基因疫苗D10接種BALB/c小鼠誘導產(chǎn)生的抗體(橫坐標中的L、M和H分別代表低劑量、中等劑量和高劑量)Fig.4 Antibody responsesin BALB/cmice immunized with different immune doses of D10 DNA vaccine(L，M and H represent low-dose、middledose and high-dose group，respectively)

表1 D10基因疫苗免疫后兔血清IgG體外對3D7蟲株生長的影響Tab.1 Evaluation of inhibitory activities against 3D7 of D10 DNA vaccine-elicited antibodies in vitro

選擇優(yōu)化的表達載體可以提升抗原的表達效率，從而提高疫苗的免疫效果。本研究選用真核表達載體pVAX1和VR1012分別對M.RCAg-1和D10基因進行表達。這兩種載體的共有特點是都用卡那霉素抗性篩選基因，減少抗性篩選基因和人類基因組發(fā)生重組的可能性;強啟動子 pCMV和 BGH poly A信號可以在哺乳動物細胞中高水平表達重組蛋白。此外，pVAX1是由美國食品和藥品管理委員會(FDA)推薦的唯一可以應用于人體實驗的載體質(zhì)粒，具有更高的生物安全性;這一載體分子量小，表達容量大［8］。本實驗研究證明M.RCAg-1基因在pVAX1中表達的免疫效果與VR1012相同。而D10基因在pVAX1中的表達的免疫效果優(yōu)于VR1012，所以在劑量摸索的試驗中應用pVAX1表達載體。

免疫劑量是影響免疫效果的另一重要因素。過高的免疫劑量不但不能提高機體的免疫效果，反而會產(chǎn)生免疫抑制，同時也會增加經(jīng)濟投入。反之，劑量過小，不能刺激機體產(chǎn)生良好的免疫應答［9］。為了尋找 M.RCAg-1和 D10基因疫苗的最佳免疫劑量，本實驗分3個劑量組(10，30，100 μg)免疫。結果證明 10 μg/鼠的劑量就足夠誘導1/102 400的抗體滴度，增加免疫劑量到 30 μg/鼠時也不會使抗體滴度繼續(xù)增加，當抗原過量達到100 μg/鼠時還會抑制抗體的產(chǎn)生。

對DNA疫苗進行優(yōu)化還包括采用高效的基因遞送途徑。動物實驗的研究結果表明體內(nèi)電穿孔的免疫途徑可以減緩肌細胞的周轉(zhuǎn)率，從而延長抗原的生成時間［6］。因此，體內(nèi)電穿孔作為肌肉注射的一種重要的輔助方法顯示出了良好的應用前景，并可以增強DNA疫苗在多種動物中的免疫原性［4-6］。根據(jù)本實驗室前期的研究結果顯示，肌肉注射 VR1012-M.RCAg-1基因疫苗 100 μg/鼠可誘導1/1 600的抗體滴度［10］，而本實驗通過電穿孔的傳遞方法免疫VR1012-M.RCAg-1基因疫苗10 μg/鼠即可誘導1/102 400的抗體滴度，可見電穿孔方法免疫可以提高基因的免疫效果。而且pVAX1-D10基因免疫兔血清IgG在濃度為2 mg/mL時對3D7的抑制率是45%，這個結果與本試驗室前期用D10重組蛋白免疫結果接近［3］?？梢姂秒姶┛追椒▊鬟fDNA疫苗同樣可以誘導抗惡性瘧生長的抗體，而且制備和純化更加方便，是一種理想的基因遞送途徑。

4 結論

影響DNA疫苗的免疫效果的因素很多，如基因的表達載體、接種方式和免疫劑量等。通過實驗發(fā)現(xiàn)，電穿孔的免疫途徑與傳統(tǒng)的肌肉注射方法相比提高了基因的免疫效果，同時還減少了免疫劑量。對于D10基因，pVAX1表達載體的免疫效果優(yōu)于VR1012載體，為今后D10基因疫苗的研究提供更好的表達載體。在劑量的摸索中發(fā)現(xiàn)10 μg/鼠是最佳的免疫劑量。M.RCAg-1和D10的DNA疫苗的免疫血清均可識別惡性瘧天然蛋白，并且D10基因免疫血清IgG在體外對惡性瘧的生長進行抑制。另外，還有其他的方法可以提高DNA疫苗的免疫效果，需要在以后的工作中進行更多的研究。

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