胰島干細胞分離全程溫度控制系統(tǒng)的研制

馮靖祎 胡 亮

（浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院生物醫(yī)學工程科，杭州 310003）

引言

糖尿病是一種嚴重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病。糖尿病對人類健康危害最大的是在動脈硬化及微血管病變基礎(chǔ)上產(chǎn)生的多種慢性并發(fā)癥，糖尿病已被列為繼心血管疾病及腫瘤之后人類的第三大疾病。在治療方法上，藥物與胰島素治療無法解決糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的問題；胰腺移植因手術(shù)創(chuàng)傷大、外科并發(fā)癥多，治療風險較大，并非糖尿病治療的最佳方法；胰島移植可以改善內(nèi)分泌功能，對血糖代謝進行自我生理性調(diào)節(jié)，降低糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生率和提高患者的生活質(zhì)量，它具有移植手術(shù)風險小，成功率高，并發(fā)癥少，可重復(fù)移植，免疫抑制劑用量小，可達到胰腺移植相似的治療效果，移植后可實時控制患者的血糖，因此胰島移植是目前最理想的糖尿病治療方法之一。

2000年，出現(xiàn)了使用2～4個胰腺進行分離，多次移植，使1型糖尿病患者完全擺脫胰島素的方法［1］。目前成人胰島細胞移植作為治療糖尿病的一種新方法，已經(jīng)展現(xiàn)出極其廣闊的臨床應(yīng)用前景及巨大的社會與經(jīng)濟效益［2-3］。

從供體中分離出高活性和高數(shù)量的胰島干細胞是成人胰島干細胞移植成功的關(guān)鍵［4-5］。用于胰島干細胞分離的復(fù)合膠原酶的活性和溫度是密切相關(guān)的，一個好的胰島干細胞分離過程的溫度控制系統(tǒng)，可以提高胰島干細胞分離的數(shù)量和質(zhì)量，從而提高胰島干細胞移植手術(shù)的成功率。

1 系統(tǒng)設(shè)計

系統(tǒng)的設(shè)計目的是通過對溫度控制對象（胰島分離消化罐）進行系統(tǒng)建模，采用PID控制方式，結(jié)合系統(tǒng)硬件與軟件的設(shè)計，提高進行胰島干細胞分離的消化罐的溫度控制性能。

1.1 被控對象對溫度的要求

胰島干細胞分離過程首先要求在溫度（4±0.5）℃的情況下，對供體胰腺灌注復(fù)合膠原酶溶液（HI Liberase，0.5g，350mL），使胰腺膨脹；然后，將胰腺剪切成5～6塊，迅速升溫到37℃（±0.3℃）進行機械震蕩消化，消化完畢后溫度再降到（4±0.5）℃，并加入稀釋液終止消化；最后，利用COBE2991胰島細胞分離機收集純化的胰島干細胞。復(fù)合膠原酶對胰腺的催化效率在4℃時基本不催化，在37℃時催化效率最佳。因此系統(tǒng)對溫度控制精度的要求很高，溫度控制過程有升溫過程和降溫過程，而且要求有一定的升降溫速（10min內(nèi)能夠到達設(shè)定溫度），系統(tǒng)升降溫溫度過沖小于0.5℃，恒溫溫度波動小于±0.3℃。

1.2 系統(tǒng)硬件設(shè)計

系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)框圖如圖1所示。

圖1 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)框圖Fig.1 System block diagram

由負溫度系數(shù)熱敏電阻溫度傳感器構(gòu)成的檢測電路將消化罐的溫度轉(zhuǎn)換成電信號，并經(jīng)對數(shù)放大電路進行線性校正后，送入CPU芯片（STC12C5A60AD/S2）進行A/D轉(zhuǎn)換；然后，該處理器把所測的溫度值送LCD液晶屏顯示，同時將其與鍵盤設(shè)定的溫度值進行比較，并將差值經(jīng)PID（proportion integration differentiation）控制器處理后，通過PWM脈寬調(diào)制器（pulse width modulation）控制功率輸出電路，實現(xiàn)對熱電冷卻器（thermoelectric cooler，TEC）的精確控制，由此構(gòu)成實時閉環(huán)負反饋溫度控制系統(tǒng)。

1.2.1 溫度檢測與放大電路的設(shè)計

系統(tǒng)被控對象要求溫度恒溫穩(wěn)定、變溫迅速，這就對系統(tǒng)的溫度測量提出了很高的要求。溫度傳感器采用10kΩ的負溫度系數(shù)熱敏電阻溫度傳感器。對于負溫度系數(shù)的熱敏電阻而言，其阻值與溫度之間的關(guān)系可以表示為［6］：

式中，RT、R0是溫度在T、T0時熱敏電阻的阻值；B是熱敏系數(shù)，T0=198.15K

由式（1）可知負溫度系數(shù)熱敏電阻器溫度-電阻的變化是非線性的，采用對數(shù)放大電路對由負溫度系數(shù)熱敏電阻器構(gòu)成的檢測電路進行線性校正。系統(tǒng)的溫度檢測與放大電路如圖2所示。

圖2 溫度檢測與放大電路圖Fig.2 Temperature detection and amplification circuit

1.2.2 功率輸出控制電路

由單片機根據(jù)PID控制算法計算出控制量，輸出占空比隨控制量變化而變的方波工作電壓，對加在熱電冷卻器變溫元件兩端的電壓實行PWM脈寬調(diào)制控制，從而實現(xiàn)對系統(tǒng)的精確溫度控制。系統(tǒng)通過采用H橋電路改變加在熱電冷卻器變溫元件兩端工作電壓的極性，實現(xiàn)對系統(tǒng)的加熱與制冷的切換，H橋電路如圖3所示。

圖3 H橋驅(qū)動控制電路圖Fig.3 H-bridge drive control circuit

當系統(tǒng)需要加熱時，CPU輸出控制信號使Q1與Q4導通，Q2與Q3截止，TEC變溫元件正向?qū)訜?；當系統(tǒng)需要制冷時，CPU輸出控制信號使Q2與Q3導通，Q1與Q4截止，TEC變溫元件反向通電制冷。

1.2 系統(tǒng)軟件控制策略

1.2.1 PID調(diào)節(jié)器的控制策略

PID控制器是一種比例、積分、微分并聯(lián)負反饋控制器，其系統(tǒng)框圖如圖4所示。

圖4 PID控制系統(tǒng)框圖Fig.4 PID control system block diagram

PID控制系統(tǒng)輸出的電壓u（t）為

式中，Kp為比例系數(shù)，Ti為積分時間常數(shù)，Td為微分時間常數(shù)。

在離散時間控制系統(tǒng)中，PID控制系統(tǒng)用差分方程表示為

根據(jù)Ziegler-Nichle條件［7］，令

式中，Tk為臨界震蕩周期。代入式（4）得

這是一種簡化的擴充臨界比例整定法，又稱歸一參數(shù)整定法（由于其只需整定一個參數(shù)，因而適合計算機自整定）。該方法采用時間乘絕對誤差積分（integral of time-weighted absolute error，ITAE）準則

式（6）的算法可變換為

實驗中，N取值10，T為采樣周期，由于在整個過程中T不變，所以計算最小值等效于求

由式（6）可以看出，當取最小值時，控制系統(tǒng)的狀態(tài)為最佳。它具有對單位階躍響應(yīng)的初始誤差考慮少，著重權(quán)衡瞬態(tài)響應(yīng)后期出現(xiàn)的誤差。應(yīng)用這種準則設(shè)計的系統(tǒng)超調(diào)量小，抗干擾能力強，具有良好的選擇性和靈敏度。

1.2.2 增量式PID控制算法

每次計算ITAE的值，并與上次得到的ITAEn-1的值進行比較，可以根據(jù)ITAE*的變化趨勢對PID算法式中的參數(shù)進行修正，但是由于偏差的累加作用容易產(chǎn)生較大的累積偏差，使控制系統(tǒng)出現(xiàn)不良的超調(diào)現(xiàn)象［8］。增量式PID控制算法是通過前3次采樣周期內(nèi)的偏差信號e，en-1，en-2，即可計算出本次采樣周期內(nèi)的控制變量u的增量Δu的一種控制算法。

采用增量式PID控制算法，計算公式可以寫為

1.2.3 PID控制系統(tǒng)參數(shù)自整定流程

PID控制系統(tǒng)參數(shù)自整定流程見圖5。

圖5 參數(shù)自整定流程Fig.5 Parameter self-tuning flow diagram

2 實驗結(jié)果

對系統(tǒng)進行了模擬胰島干細胞分離過程的溫度測試，然后在我院胰島實驗室進行了小鼠的胰島干細胞的分離試用。

2.1 系統(tǒng)溫度控制性能測試

實驗時采用200mL生理鹽水代替胰腺與膠原酶混合物。系統(tǒng)溫度測試的測溫儀（Fluke51Ⅱ，美國）經(jīng)浙江省計量科學研究院檢測校準，系統(tǒng)溫度測試如圖6所示。

圖6 系統(tǒng)溫度測試圖Fig.6 System temperature testing diagram

測溫儀的溫度傳感器放置在消化罐內(nèi)部中央，8塊熱電冷卻器變溫元件放置在消化罐的底部。通過外接蠕動泵使不銹鋼消化罐內(nèi)的液體溫度均勻。開始測量前消化罐內(nèi)的水溫19.7℃，環(huán)境溫度20.5℃。首先測試系統(tǒng)由環(huán)境溫度降到4.0℃，降溫速率與保持4.0℃恒溫的效果，然后測試系統(tǒng)由4.0℃升到37.0℃，升溫速率與保持37.0℃恒溫的效果。測試結(jié)果如圖7所示。由圖7可知系統(tǒng)消化罐的溫度由19.7℃降到4.0℃所需時間大約6min，由4.0℃升到37.0℃并恒定所需時間為7min，系統(tǒng)在升降溫速率方面達到了既定的目標和要求。

圖7 系統(tǒng)升降溫示意Fig.7 Schematic diagram of heating and cooling system

系統(tǒng)在升溫到37.0℃并恒定時的溫度過沖和恒溫效果如圖8所示。由圖8可知在系統(tǒng)加溫到37℃并恒溫控制時，溫度過沖小于0.5℃，恒溫波動小于0.3℃。

圖8 系統(tǒng)37℃恒溫效果示意Fig.8 Schematic diagram of the system results at keeping 37℃

2.2 系統(tǒng)使用前后實驗小鼠的胰島干細胞分離效果

圖9 不同溫度控制方法的胰島分離結(jié)果。（a）水浴法；（b）半導體變溫法Fig.9 Islet isolation results diagram by different temperature control.（a）water bathing method；（b）semiconductor temperature method

在本系統(tǒng)投入使用前，采用水浴法來控制胰腺的灌注與消化的溫度，胰腺的灌注在底部放滿冰的不銹鋼盤子里進行，灌注時溫度（6±3）℃，灌注時間為2min；胰腺的消化在DK-8D型電熱恒溫水槽內(nèi)進行，消化溫度（37±2.5）℃，消化時間為12min。系統(tǒng)投入使用后，胰腺的灌注在半導體變溫溫度控制系統(tǒng)的消化罐里進行，灌注時溫度（4±0.5）℃，灌注時間為2min；胰腺的消化也在半導體變溫溫度控制系統(tǒng)的消化罐里進行，消化溫度（37±0.5）℃，消化時間為12min。表1是在其它條件相同的情況下，不同的胰腺分離過程溫度控制方式分離純化后獲得的胰島得率和純度。由表1可以看出在系統(tǒng)的投入運行后胰島干細胞的數(shù)量和質(zhì)量都有明顯的提高。可見對胰島分離過程溫度的精確控制可以提高胰島分離的數(shù)量和活性。

表1 分離胰島得率純度表Tab.1 Purity of isolated islet yield table

圖9（a）是胰腺灌注與分離溫度控制采用水浴法得到的消化完畢的胰腺分離結(jié)果；圖9（b）是采用本半導體變溫系統(tǒng)得到的消化完畢的胰腺分離結(jié)果。從中可以看出系統(tǒng)投入應(yīng)用后，實驗小鼠胰島分離的數(shù)量有明顯的提高。

3 結(jié)論與展望

本研究設(shè)計了一種利用熱電冷卻器的制熱與制冷功能，對胰島干細胞分離過程進行精確溫度控制的系統(tǒng)。通過對系統(tǒng)的溫度控制測試，系統(tǒng)變溫溫度過沖小于0.5℃，恒溫溫度波動小于±0.3℃。系統(tǒng)投入使用后，實驗小鼠胰島分離的數(shù)量和活性都有了提高。隨著熱電冷卻器材料技術(shù)的不斷發(fā)展，熱電冷卻器的變溫性能會越來越高，同時基于單片機的溫度控制技術(shù)也越來越成熟，熱電冷卻器變溫技術(shù)將在更多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

實驗鼠胰島干細胞的分離純化是一個較復(fù)雜的技術(shù)，獲得的胰島干細胞的數(shù)量和質(zhì)量受很多因素的影響［9-10］，溫度只是胰島分離過程的一個重要因素之一。此外，胰島干細胞的分離純化過程操作復(fù)雜，人為影響因素較多，導致分離結(jié)果個體間差異較大。今后，將對影響胰島干細胞分離的因素進行更廣泛的研究，希望找到對其具有影響的更多重要因素，以提高胰島的分離數(shù)量和質(zhì)量。同時，還將進一步研究人的胰島干細胞分離技術(shù)，以便提高人的胰島干細胞移植的成功率。

［1］Shapiro AM，Lakey JR，Ryan EA，et al.Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid free immunosuppressive regimen［J］.N Eng J Med，2000，343（4）：230-238.

［2］Couzin J.Diabetes Islet transplants face test of time［J］.Science，2004，306（5693）：34-37.

［3］Korsgren O，Nilsson B，Berme C，et al.Current status of clinical islet transplantation［J］.Transplantation，2005，79（10）：1289-1293.

［4］Lakey JRT.Current human islet isolation protocol［M］.Japan：Medical Review CO.Ltd，2004：80-81.

［5］Bertuzzi F，Secchi A，Di Carlo V.Islet transplantation in type diabetic patients［J］.Transplant Proc，2004，36：603-604.

［6］全紅娟.熱敏電阻溫度傳感器的非線性誤差分析［J］.應(yīng)用技術(shù)，2005，10：21-23.

［7］李曉帆，姚根和.高精度溫度控制技術(shù)［J］.無線電技術(shù)，2005，33：67-77.

［8］歷風滿.數(shù)字PID控制算法的研究［J］.遼寧大學學報，2005，32（4）：367-370.

［9］Haan BJ，F(xiàn)aas MM，Spijker H，et al.Factors influencing isolation of functional pancreatic rat islets［J］.Pancreas，2004，29（1）：15-18.

［10］London NJ，Swift SM，Clayton HAet al.Isolation culture and functional evaluation of islets of Langerhans［J］.Diabetes Metab，1998，24（3）：200-204.