不同脫細(xì)胞方法對(duì)周圍神經(jīng)生物力學(xué)性能的影響

楊 召 馬信龍，* 李秀蘭 馬劍雄 張 楊 郭洪剛 孫曉雷

1(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨科，天津 300052)

2(天津醫(yī)院骨科，天津 300211)

引言

目前，交通傷、戰(zhàn)爭(zhēng)及自然災(zāi)害所引發(fā)的周圍神經(jīng)損傷給患者帶來了高致殘率，并給社會(huì)及患者家庭帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，這些都使得周圍神經(jīng)損傷成為全球所面臨的嚴(yán)峻的健康問題之一［1］。如何尋求理想的周圍神經(jīng)替代移植物來提高周圍神經(jīng)的再生與愈合及重建肢體功能，成為困擾外科醫(yī)師的臨床難題。

近年來，隨著神經(jīng)細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)的深入研究，特別是組織工程學(xué)的迅猛發(fā)展，為組織工程化神經(jīng)移植物的研發(fā)啟示了新的方向，組織工程化神經(jīng)移植物應(yīng)用于周圍神經(jīng)再生已逐漸成為研究的焦點(diǎn)［2］。組織工程化神經(jīng)移植物主要包括:有活性的種子細(xì)胞和有良好生物相容性的支架材料。其中，支架材料被視為神經(jīng)源性種子細(xì)胞賴以生存的物理環(huán)境，不僅為種子細(xì)胞提供附著場(chǎng)所，而且為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支撐作用，并抗擊壓力等外力，在體內(nèi)維持組織形狀，因此，支架材料本身應(yīng)具有一定的生物力學(xué)特性。脫細(xì)胞神經(jīng)支架現(xiàn)已在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袕V泛應(yīng)用，但是國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于脫細(xì)胞神經(jīng)支架生物力學(xué)性能的報(bào)道卻極為罕見。所以本實(shí)驗(yàn)的目的就是研究脫細(xì)胞神經(jīng)支架在生物力學(xué)性能方面的差異，為組織工程化神經(jīng)構(gòu)建和臨床神經(jīng)修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

17只3月齡雄性Wistar大鼠(天津醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，天津)，體重:220～230g，動(dòng)物等級(jí)為清潔級(jí)。

1.2 試劑及儀器

Triton X-200，SB-10，SB-16(Sigma 公司，美國(guó))，軟組織生物力學(xué)測(cè)試專用冰凍卡具(Cooling capacity walts，Bose公司)、Endura TEC ELF 3200 力學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器(Bose公司，美國(guó))及其配套的 Wintest生物力學(xué)測(cè)試軟件，萬分之一精密電子天平(北京光學(xué)儀器廠，北京)、閉式四用游標(biāo)卡尺(廣陸牌，141-102)、平板振蕩器(江蘇省榮華儀器制造有限公司，江蘇)、電熱三用水箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠，北京)、光學(xué)顯微鏡(Nikon公司，日本)、場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(LEO，德國(guó))。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用10%水合氯醛0.5 mL/100 g腹腔注射麻醉，切取大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)，手術(shù)顯微鏡下去除神經(jīng)外膜上附著的脂肪組織，取20 mm長(zhǎng)坐骨神經(jīng)，共34條。隨機(jī)分為3組，A組為正常對(duì)照組，B組為物理凍融組，C組為化學(xué)萃取組。

A組(10條):神經(jīng)組織不作任何處理，取出后立即置于PBS中備用;B組(10條):神經(jīng)組織置于潔凈1.5mL塑料離心管中密封，液氮中冰凍3 min，取出后立即置于37℃水浴中3 min，重復(fù)此過程5次，制成凍融的坐骨神經(jīng)［3］;C組(14條):于25℃條件下將神經(jīng)組織置于滅菌蒸餾水中低滲處理7 h，振蕩器持續(xù)振蕩，速率80次/min;125 mmol/L SB-10溶液浸泡15 h;滅菌 PBS中振蕩 15 min;0.6 mmol/L SB-16、0.14%Triton X-200溶液浸泡24 h;滅菌PBS中振蕩3次(5 min/次);125 mmol/L SB-10溶液浸泡7 h;滅菌 PBS中振蕩 15 min;0.6 mmol/L SB-16、0.14%TritonX-200溶液中浸泡15 h;滅菌PBS中振蕩3次(5 min/次)［4］。所有步驟均在室溫下完成。

1.4 組織學(xué)觀察

1.4.1 HE染色

每組隨機(jī)選取1條坐骨神經(jīng)，修剪為5 mm的小段，10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚橫、縱切片行HE染色，光鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞、髓鞘、軸突及神經(jīng)基底膜等結(jié)構(gòu)。

1.4.2 場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡

每組隨機(jī)選取1條坐骨神經(jīng)，修剪為5 mm的小段，4%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，丙酮梯度脫水，臨界點(diǎn)干燥，真空噴金鍍膜，場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡下觀察神經(jīng)橫斷面，了解神經(jīng)細(xì)胞、髓鞘、軸突及神經(jīng)基底膜等結(jié)構(gòu)的變化。

1.5 生物力學(xué)測(cè)試

將其余樣本固定于力學(xué)儀器冰凍卡具中部，5 min后旋緊卡具確保神經(jīng)不會(huì)有各向滑動(dòng)，而兩卡具間外露的神經(jīng)仍為常溫，不會(huì)影響其拉伸時(shí)的生物力學(xué)性能。設(shè)定初始長(zhǎng)度為10 mm，每一個(gè)標(biāo)本以1 mm/min被恒速拉伸，拉力和位移每秒被取樣5次。每個(gè)樣本被拉伸至完全斷裂。在測(cè)試過程中用生理鹽水保持樣本濕潤(rùn)。讀取極限載荷(載荷-位移曲線中的最高點(diǎn)力值);讀出每個(gè)測(cè)試點(diǎn)載荷與其對(duì)應(yīng)的位移值，計(jì)算出韌度(載荷-位移曲線中直線部分的斜率)=載荷/位移(N/mm);極限應(yīng)力=極限載荷/面積 (MPa);極限應(yīng)變 =極限載荷對(duì)應(yīng)的位移/樣本的初長(zhǎng)度;彈性模量 =應(yīng)力/應(yīng)變(MPa);斷裂功耗=載荷-位移曲線中極限載荷點(diǎn)左側(cè)曲線下的面積。示例見圖1。

圖1 載荷-位移曲線示意圖Fig.1 Diagram of load-displacement curve

梯形面積求和計(jì)算公式

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HE染色

A組神經(jīng)纖維橫斷面呈大小不一的圓形，細(xì)胞核清晰，髓鞘外周淡染呈網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu);縱切面上可觀察到軸突、雪旺細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)等結(jié)構(gòu)，見圖2中(a)和(b);B組橫、縱切片上含有較多的雪旺細(xì)胞，軸突及髓鞘等絕大部分存在，但結(jié)構(gòu)紊亂，見圖3中(a)和(b));而C組在橫切片上軸突及細(xì)胞均消失，代之以神經(jīng)內(nèi)膜形成的不規(guī)則圓形空腔;縱切片上也見不到任何細(xì)胞，神經(jīng)內(nèi)膜呈波浪狀縱形排列，軸突、髓鞘結(jié)構(gòu)消失而形成管柱狀空隙，見圖4中(a)和(b)。

圖2 A組神經(jīng)的HE染色(400×)。(a)橫切面;(b)縱切面Fig.2 The HE staining of nerve in group A.(HE staining，400×).(a)cross section;(b)longitudinal section

2.2 場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡

A組神經(jīng)纖維粗細(xì)不一，中央為軸突，四周髓鞘包圍，神經(jīng)纖維表面有結(jié)締組織形成的神經(jīng)內(nèi)膜包繞髓鞘、軸突等內(nèi)容物形態(tài)清晰，見圖5;B組:神經(jīng)軸突、髓鞘、雪旺細(xì)胞變性、壞死，軸突崩裂，髓鞘裂解，堵塞基底膜管管腔，見圖6;C組髓鞘、軸突等結(jié)構(gòu)均消失，可見雪旺細(xì)胞基底膜管，基底膜管內(nèi)未見殘留結(jié)構(gòu)，官腔通暢，見圖7。

2.3 極限載荷、極限應(yīng)力、極限應(yīng)變

極限載荷:直接反映神經(jīng)的強(qiáng)度。三組中，B組的極限載荷最大，A組次之，C組最小，但三組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.154，P=0.332)。

極限應(yīng)力:作用在單位面積上的最大應(yīng)力，排除了神經(jīng)面積差異。3組中，B組的極限應(yīng)力最大，A組次之，C組最小，但3組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.381，P=0.270)。

圖3 B組神經(jīng)的 HE染色(400×)。(a)橫切面;(b)縱切面Fig.3 The HE staining of nerve in group B.(HE staining，400 ×).(a)cross section;(b)longitudinal section

極限應(yīng)變:它是某一方向上樣本在極限載荷時(shí)因變形產(chǎn)生的長(zhǎng)度增量與初長(zhǎng)度的比值。3組中，A組的極限應(yīng)變最大，C組次之，B組最小，但3組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.317，P=0.731)。

2.4 韌度、彈性模量

2.4.1 韌度

類似于胡克定律中的常數(shù)k，代表神經(jīng)抗形變、抗斷裂的特性，決定于神經(jīng)本身，能直觀反映神經(jīng)的“松散”或“堅(jiān)韌”。3組中，B組的韌度最大，C組次之，A組最小，3組間兩兩比較，A組和 B組間的韌度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.039)，其余無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=2.225，P=0.129)。

2.4.2 彈性模量

表示神經(jīng)抗形變、抗斷裂的特性，也是神經(jīng)內(nèi)在本質(zhì)的參數(shù)。3組中，B組的彈性模量最大，C次之，A組最小，3組間兩兩比較，A組和B組間的彈性模量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.014)，其余無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=3.426，P=0.048)。

圖4 C組神經(jīng)的HE染色(400×)。(a)橫切面;(b)縱切面Fig.4 The HE staining of nerve in group C(HE staining，400×).(a)cross section;(b)longitudinal section

圖5 A組神經(jīng)橫切面的掃描電鏡觀察(5000×)Fig.5 The cross-sections of nerve in group A(Field emission scanning electron microscope，5000×)

圖6 B組神經(jīng)橫切面的掃描電鏡觀察(5000×)Fig.6 The cross-sections of nerve in group B(Field emission scanning electron microscope，5000×)

圖7 C組神經(jīng)橫切面的掃描電鏡觀察(5000×)Fig.7 The cross-sections of nerve in group C.(Fieldemission scanning electron microscope，5000×)

2.5 斷裂功耗

斷裂功耗為樣本從開始拉伸到斷裂期間拉伸所做的所有功，從另一個(gè)角度反映了神經(jīng)的強(qiáng)度。3組中，B組的斷裂功耗最大，A組次之，C組最小，但3組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.512，P=0.608)。3組的極限載荷、韌度、斷裂功耗等見表1。

3 討論

良好的組織工程神經(jīng)支架材料要求:①具有良好的生物相容性和可降解性，能與周圍組織融為一體，并支持神經(jīng)再生及成熟;②材料本身應(yīng)具備良好的生物力學(xué)性能(強(qiáng)度、彈性模量等);③提供種子細(xì)胞依附的框架，并作為種子細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)揮正常生物作用的有效載體;④具有足夠的長(zhǎng)度和直徑;迄今為止，組織工程神經(jīng)支架材料主要由人工合成材料和天然材料制成。人工合成支架材料包括不可吸收和可吸收的支架材料，不可吸收的人工合成支架材料的主要代表是硅膠管;可吸收的人工合成支架材料常用的有:聚羥基乙酸(Polyglycolic acid，PGA)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)、PGA/PLA共聚物等。天然支架材料主要包括生物膜、纖維蛋白、膠原、自體靜脈、骨骼肌、水凝膠、自體神經(jīng)、同種異體神經(jīng)等。

表1 3組周圍神經(jīng)的生物力學(xué)特性±s，n=28)Tab.1 The biomechanical properties of peripheral nerve in group A、B、C(ˉx ± s，n=28)

表1 3組周圍神經(jīng)的生物力學(xué)特性±s，n=28)Tab.1 The biomechanical properties of peripheral nerve in group A、B、C(ˉx ± s，n=28)

分組 極限載荷/N 韌度/(N/mm)極限應(yīng)力/MPa 極限應(yīng)變 彈性模量/MPa 斷裂功耗/10－3J A組 5.61±1.18 1.54±0.21 7.14±1.50 0.49±0.09 19.33±2.00 12.89±4.56 B組 6.44±0.98 2.29±0.41 8.20±1.25 0.44±0.10 26.70±5.22 13.01±4.14 C組 5.46±1.83 1.84±0.60 6.95±1.35 0.45±0.11 24.10±7.41 11.54±4.69

實(shí)驗(yàn)研究的脫細(xì)胞神經(jīng)支架屬于天然支架材料。已有研究證實(shí):天然組織工程支架能為細(xì)胞提供近似體內(nèi)的自然微環(huán)境［5-6］。并且經(jīng)特殊處理消除其抗原性后，生物材料所保留的成分具有誘導(dǎo)組織再生的能力，移植后可誘導(dǎo)細(xì)胞及膠原沉積，促進(jìn)移植物快速血管化［7］。脫細(xì)胞神經(jīng)支架用于修復(fù)周圍神經(jīng)缺損已被實(shí)驗(yàn)證明是有效的［8－11］。

神經(jīng)支架不僅為細(xì)胞提供附著場(chǎng)所、結(jié)構(gòu)支撐的作用，其還必須具備與其修復(fù)的組織及周圍力學(xué)環(huán)境相適應(yīng)的生物力學(xué)性能(強(qiáng)度、彈性模量等)，以更好的適應(yīng)新生的修復(fù)細(xì)胞和組織替代的過程。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與新鮮神經(jīng)相比，兩種方法處理后神經(jīng)的生物力學(xué)特性經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)基本無明顯差異。而化學(xué)方法處理后的神經(jīng)，一些生物力學(xué)特性有所下降，但這種下降經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢妴渭兙蜕锪W(xué)特性而言，兩種方法處理后的神經(jīng)均適合在移植中應(yīng)用。

周圍神經(jīng)最強(qiáng)健的結(jié)締組織層是神經(jīng)束膜，其次是神經(jīng)外膜［12］。神經(jīng)束膜、神經(jīng)外膜細(xì)胞外基質(zhì)(Extrac-ellular Matrix，ECM)組分的不同可能對(duì)脫細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物力學(xué)性能有很大影響。化學(xué)萃取的過程也可能使ECM某一分子的數(shù)量減少，也就是說，脫細(xì)胞過程可能在一定程度上去除了一種或更多ECM組分，從而使得斷裂前可吸收的能量減少［13］。而物理凍融組卻不存在這種情況?？梢姡煌椒ūＡ艏?xì)胞外基質(zhì)的效果不同，這就使得兩種方法處理的神經(jīng)呈現(xiàn)出不同的生物力學(xué)特性。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)作為一種神經(jīng)組織工程支架材料，通過脫細(xì)胞處理降低其免疫原性，并保留細(xì)胞外基質(zhì)，從脫細(xì)胞后神經(jīng)基質(zhì)的組織學(xué)和生物力學(xué)性質(zhì)兩方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，研究表明，與物理方法相比，化學(xué)方法能很好的去除雪旺細(xì)胞、軸突和髓鞘，并可以保證神經(jīng)支架的生物力學(xué)特性。因此，經(jīng)化學(xué)方法處理后的神經(jīng)支架更適宜在移植中應(yīng)用。

［1］Scholz T，Krichevsky A，Sumarto A，et al.Peripheral nerve injuries:an international survey of current treatments and future perspectives［J］.Reconstr Microsurg，2009，25(6):339 －344.

［2］Subramanian A，Krishnan UM，Sethuraman S.Development of biomaterial scaffold for nerve tissue engineering:Biomaterial mediated neural regeneration ［J］.Biomed Sci，2009，25(16):108.

［3］Cui Qi，Polett MA，Symons NA，et al.A new approach to CNS repair using chimeric peripheral nerve graft［J］.Neurotraum，2003，20(1):17 －31

［4］高嵩濤，鄧展生，李寶軍，等.不同去細(xì)胞神經(jīng)支架制備方法的對(duì)比研究［J］.中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2008，22(7):851－855.

［5］Campbell GR，Campbell JH.Development of tissue engineered vascular grafts［J］.Curr Pharm Biotechnol，2007，8(1):43 －50.

［6］TamerlerC， Sarikaya M.Molecularbiomimetics:utilizing nature’s molecular ways in practical engineering ［J］.Acta Biomater，2007，3(3):289 － 299.

［7］Freytes DO，Rundell AE，Vande Geest J，et al.Analytically derived material properties of multilaminated extracellular matrix devices using the ball burst test［J］.Biomaterials，2005，26(27):5518－5531.

［8］Neubauer D，Graham JB，Muir D.Chondroitinase treatment increases the effective length of acellular nerve grafts［J］.Exp Neurol，2007，207(1):163 － 170.

［9］Pfister LA，Papaloizos M，Merlde HP，et al.Nerve conduits and growth factor delivery in peripheral nerve repair［J］.Peripher Nerv Syst，2007，12(2):65 －82.

［10］Zhong Hongbin， Chen Bingyao， Lu Shibi， etal. Nerve regeneration and functional recovery after a sciatic nerve gap is repaired by an acellular nerve allograft made through chemical extraction in canines. ［J］.Reconstr Microsurg，2007，23(8):479－487.

［11］Connolly SS，Yoo JJ，Abouheba M，et al.Cavernous nerve regeneration using acellular nerve grafts［J］.World J Urol.2008，26(4):333 －339.

［12］Rydevik BL，Lundborg G，Olmarker K，et al.Biomechanics of peripheral nerves and spinal nerve roots［M］//Nordin M，F(xiàn)rankel VH eds.Basic Biomechanics of the Musculoskeletal System.Baltimore:Lippincott Williams＆Wilkins，2001:126－146.

［13］Borschel GH，Kia KF，Kuzon WM Jr， et al.Mechanical properties of acellular peripheral nerve ［J］.Surg Res，2003，114(2):133－139.