順鉑降低銅離子轉(zhuǎn)運蛋白1表達誘導(dǎo)人食管鱗癌細胞耐藥

余 樂，陳明輝，古春萍，李亦蕾，曹之憲，劉叔文

(南方醫(yī)科大學(xué)1.藥學(xué)院、2.附屬南方醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州 510515;3.香港中文大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院，香港)

食管癌是一種常見的惡性腫瘤，發(fā)病率在我國居惡性腫瘤的第4位。西方國家食管癌患者主要組織學(xué)類型是食管腺癌，而我國絕大部分是食管鱗癌［1］。我國的中部地區(qū)，包括河南省和山西省，據(jù)報道是世界上食管鱗癌發(fā)病率最高的地區(qū)［2］。對于局部食管癌患者，手術(shù)切除是首選的治療方案。然而臨床上近50%的食管癌患者在確診時已有轉(zhuǎn)移，這些患者則主要依賴于化學(xué)治療［3－4］?；煹男ЧQ于腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。然而，在接受化療的過程中，食管鱗癌細胞往往對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，最終導(dǎo)致化療的失敗。盡管對于腫瘤細胞耐藥性的產(chǎn)生已開展了深入的研究，但是耐藥性產(chǎn)生的機制以及如何克服耐藥性的產(chǎn)生從而提高化療效果，仍有待進一步闡明。本研究通過濃度梯度遞增法誘導(dǎo)出了對順鉑耐藥的人食管鱗癌細胞HKESC-1/cis，測定了耐藥細胞及其親代細胞的生長曲線，觀察了順鉑處理后耐藥細胞和親代細胞對順鉑的蓄積以及Pt-DNA加合物的形成是否存在差異，并進一步探討了順鉑耐藥性產(chǎn)生的機制，以期為臨床上逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料MEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。胎牛血清、青霉素、鏈霉素和胰酶購自美國Invitrogen公司。檢測銅離子轉(zhuǎn)運蛋白(copper transporter 1，CTR1)的抗體購自美國Santa Cruz公司。檢測β-actin的抗體、二抗、ECL發(fā)光試劑，購自美國Cell Signaling公司。Wizard Genomic DNA Purification Kit購自美國Promega公司。SDS-PAGE的儀器和試劑來自美國Bio-Rad公司。其他試劑均購自美國Sigma公司。

1.2細胞培養(yǎng)及耐藥細胞株HKESC-1/cis建立人食管鱗癌細胞株HKESC-1由香港大學(xué)病理系Srivastava G教授饋贈。細胞在MEM培養(yǎng)基，含體積分數(shù)為10%胎牛血清，100 kU·L－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素，37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代。采用濃度梯度遞增法誘導(dǎo)耐藥株:HKESC-1細胞接種于含0.1 μmol·L－1順鉑的培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)，部分細胞死亡，存活細胞緩慢生長，穩(wěn)定后增加藥物劑量，從0.1、0.5、1、2、5 直至10 μmol·L－1，經(jīng) 6 個月誘導(dǎo)而成，命名為HKESC-1/cis。在誘導(dǎo)過程中，若出現(xiàn)80%以上的細胞死亡，則棄去含藥培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待其恢復(fù)對數(shù)生長后繼續(xù)使用藥物誘導(dǎo)。

1.3MTT法檢測順鉑對細胞的殺傷作用并計算IC50取對數(shù)生長期的細胞，以6 000/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)基，加入不同濃度的順鉑孵育48 h。吸棄含藥培養(yǎng)基，加入MTT(終濃度為0.5 g·L－1)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸盡培養(yǎng)基，加入DMSO使MTT還原產(chǎn)物完全溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm波長處檢測OD值。半數(shù)抑制濃度IC50通過Prism 4.0統(tǒng)計軟件計算。

1.4電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)檢測細胞內(nèi)順鉑含量和Pt-DNA加合物的形成ICP-MS通過檢測樣品中鉑(Pt)的含量來直接反映順鉑的含量。檢測細胞內(nèi)順鉑的方法參考文獻報道［5－6］并做了部分修改。取對數(shù)生長期的細胞，以2×105/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。順鉑(30 μmol·L－1)處理細胞2 h后，用冷PBS緩沖液沖洗細胞5次以充分洗去細胞外的順鉑。加215 μl 70%的硝酸到各孔直接裂解細胞。收集裂解液至EP管并于65℃下溶解2 h。檢測前用去離子水將樣品中的硝酸稀釋至10%。細胞內(nèi)順鉑含量用細胞總蛋白做歸一化。

對于Pt-DNA加合物形成的檢測，取對數(shù)生長期的細胞，以1×106/孔接種于10 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h。順鉑(30 μmol·L－1)處理細胞2 h后，用冷PBS緩沖液沖洗細胞5次以充分洗去細胞外的順鉑。按說明書用Wizard Genomic DNA Purification Kit提取基因組 DNA并定量 DNA含量。將DNA溶解在 70 μl去離子水中，然后加入 215 μl 70%的硝酸，樣品于65℃下溶解2 h。檢測前用去離子水將樣品中的硝酸稀釋至10%。Pt-DNA加合物的形成用DNA量做歸一化。Pt含量使用Thermo X SeriesⅡICP-MS檢測。1 ppb銦作為內(nèi)參監(jiān)測檢測過程中儀器的穩(wěn)定性。

1.5Western blotRIPA緩沖液裂解細胞提取總蛋白。RIPA緩沖液的配制及其含有的蛋白酶和磷酸酶抑制劑配方參看我們以前的描述［7］。BCA測定蛋白濃度后，以50 μg總蛋白量上樣后SDS-PAGE電泳，然后用濕法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)印至醋酸纖維素膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，洗膜，加二抗，室溫孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光，顯影，定影。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)以±s比較表示，應(yīng)用Prism 4.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1順鉑抗性細胞株HKESC-1/cis的建立采用濃度梯度遞增的方法對HKESC-1細胞株進行體外誘導(dǎo)，得到人食管鱗癌耐藥細胞株HKESC-1/cis。耐藥細胞呈多邊形上皮樣生長，形態(tài)與親代細胞沒有明顯的區(qū)別。連續(xù)培養(yǎng)HKESC-1和HKESC-1/cis細胞7 d，然后MTT法測定細胞的生長曲線。結(jié)果表明耐藥細胞和親代細胞體外增殖速度相似，沒有差別。MTT法測得HKESC-1細胞對順鉑的IC50為(4.5 ±0.2)μmol·L－1，而 HKESC-1/cis細胞對順鉑的 IC50增加至(12.9 ±0.4)μmol·L－1，其耐藥指數(shù)為2.9(Fig 1)。并且HKESC-1/cis細胞在無順鉑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4個月，通過定期測定其對順鉑的IC50，我們發(fā)現(xiàn)該細胞穩(wěn)定的保持著對順鉑的耐藥性。

Fig 1 Cell viability curves of cisplatin-resistant cell line HKESC-1/cis and its parental counterpart HKESC-1 following 48-h exposure to cisplatin as determined by MTT assay

2.2HKESC-1/cis細胞內(nèi)順鉑的含量以及Pt-DNA加合物形成均低于其親代細胞順鉑在腫瘤細胞內(nèi)的蓄積，是細胞對順鉑是否敏感的決定因素［8］。為了準確檢測細胞內(nèi)順鉑的含量，需要保證細胞膜的完整以免因為細胞膜的破損而干擾實驗結(jié)果。我們采用順鉑短時間(2 h)處理細胞的方案［9］，該條件下通過顯微鏡觀察，細胞形態(tài)完整，與對照組比較沒有區(qū)別。我們比較了順鉑耐藥細胞HKESC-1/cis與其親代細胞HKESC-1在順鉑處理后細胞內(nèi)順鉑的含量，結(jié)果表明耐藥細胞的胞內(nèi)順鉑蓄積低于其親代細胞(P＜0.01，F(xiàn)ig 2A)。

順鉑發(fā)揮其細胞毒作用主要通過與腫瘤細胞的DNA結(jié)合生成Pt-DNA加合物，引起DNA損傷而抑制細胞增殖，并進一步引起細胞凋亡［10］。因此，我們比較了順鉑耐藥細胞HKESC-1/cis與其親代細胞HKESC-1在順鉑處理后細胞內(nèi)Pt-DNA加合物的形成，結(jié)果表明順鉑耐藥細胞Pt-DNA加合物的形成低于其親代細胞(P＜0.01，F(xiàn)ig 2B)。

2.3HKESC-1/cis細胞CTR1表達降低由于順鉑的分子極性高，胞外順鉑不容易擴散穿過細胞膜進入細胞內(nèi)。CTR1是主要的銅輸入轉(zhuǎn)運體(copper influx transporter)。研究已發(fā)現(xiàn)CTR1不僅介導(dǎo)胞外銅離子轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)，而且參與順鉑轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)［11－13］?？紤]到順鉑耐藥，細胞內(nèi)順鉑的蓄積較其親代細胞有明顯的下降，我們推測可能與胞外順鉑進入胞內(nèi)的過程受到抑制有關(guān)。為此，我們檢測了順鉑耐藥細胞HKESC-1/cis和其親代細胞HKESC-1的CTR1蛋白表達，結(jié)果顯示耐藥細胞CTR1蛋白的表達水平均明顯低于其親代細胞(Fig 3)。此外，盡管有研究發(fā)現(xiàn)順鉑短時間處理細胞會快速下調(diào)CTR1的蛋白水平，但我們的研究顯示順鉑短時間處理細胞并不引起CTR1蛋白的改變(Fig 3)。

Fig 2 Whole-cell cisplatin accumulation(A)and Pt-DNA adduct formation(B)in response to 2 h exposure of 30 μmol·L-1cisplatin in cisplatin-resistant cell line HKESC-1/cis and its parental counterpart HKESC-1 as determined by ICP-MS

Fig 3 The protein expression of CTR1 in response to 5 min exposure of 30 μmol·L-1cisplatin in cisplatin-resistant cell line HKESC-1/cis and its parental counterpart HKESC-1 as determined by Western blot

3 討論

腫瘤細胞耐藥性的產(chǎn)生目前仍然是腫瘤治療的主要障礙，也是化療失敗的重要原因。順鉑是食管鱗癌治療的基本化療藥物，在食管鱗癌的臨床治療中發(fā)揮著重要的作用，然而腫瘤細胞耐藥性的產(chǎn)生嚴重限制了順鉑的抗腫瘤效果。在體外建立腫瘤耐藥細胞株，能為腫瘤細胞耐藥性機制及抗藥性逆轉(zhuǎn)的研究提供重要的手段和模型［14］。通過濃度梯度遞增法處理人食管鱗癌細胞HKESC-1，我們誘導(dǎo)出了具有順鉑抗性的耐藥細胞株HKEC-1/cis，耐藥細胞對順鉑的抗性是親代細胞的2.9倍。更為重要的是，耐藥細胞株在無順鉑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4個月后對順鉑的抗性仍保持不變，表明HKESC-1/cis具有穩(wěn)定的順鉑耐藥性。因此，我們認為這一耐藥細胞株能夠用于細胞耐藥性產(chǎn)生的機制研究。

順鉑進入細胞后與DNA嘌呤堿基親核的N7位結(jié)合形成鏈內(nèi)和鏈間的交叉聯(lián)接，從而破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致細胞的死亡［15］。考慮到Pt-DNA加合物的形成與順鉑發(fā)揮細胞毒作用之間的相關(guān)性，我們檢測了HKESC-1/cis及其親代細胞在順鉑處理后細胞內(nèi)順鉑的蓄積以及Pt-DNA加合物的形成。結(jié)果顯示，HKESC-1/cis細胞內(nèi)順鉑的蓄積以及Pt-DNA加合物的形成均比其親代細胞HKESC-1少。另外，細胞內(nèi)順鉑蓄積的減少和Pt-DNA加合物形成的減少程度相當(dāng)。這一結(jié)果提示我們進入細胞內(nèi)的順鉑量很可能決定了多少順鉑可以進入細胞核并與DNA結(jié)合形成加合物。細胞內(nèi)順鉑的蓄積以及Pt-DNA加合物的減少可以解釋HKESC-1/cis細胞對順鉑的耐藥性。

順鉑分子極性高，不容易擴散穿過脂質(zhì)細胞膜。CTR1是順鉑的主要膜轉(zhuǎn)運蛋白。敲除CTR1在體外和體內(nèi)均可導(dǎo)致腫瘤細胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性［13，16］。通過檢測細胞 CTR1蛋白的表達水平，我們發(fā)現(xiàn)順鉑耐性細胞株HKESC-1/cis與其親代細胞相比，CTR1蛋白水平明顯降低。這一結(jié)果提示我們，耐藥細胞株CTR1蛋白表達的降低抑制了順鉑進入細胞，從而減少了順鉑在細胞內(nèi)的蓄積。盡管已有文獻報道順鉑短期(5 min內(nèi))處理一些細胞可引起CTR1蛋白的快速降解而導(dǎo)致CTR1蛋白水平的下降［11－12］。然而，在我們檢測的順鉑耐藥性細胞和其親代細胞中并未發(fā)現(xiàn)相同的現(xiàn)象。順鉑短期(5 min)處理這些細胞后，CTR1蛋白表達水平不變?？紤]到本研究中的順鉑耐藥細胞株是通過順鉑長時間處理(6個月)誘導(dǎo)出來的，我們推斷人食管鱗癌細胞需要經(jīng)順鉑長期處理，才能下調(diào)CTR1蛋白的表達水平。

CTR1在順鉑進入細胞過程中起著重要作用。因此，通過調(diào)節(jié)CTR1功能增加順鉑進入細胞，可望提高順鉑的細胞毒性作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，一些化合物和順鉑合用后可增強順鉑的細胞毒作用，比如銅離子螯合物和蛋白酶抑制劑。銅離子螯合劑可上調(diào)CTR1蛋白的表達，而蛋白酶抑制劑則能抑制CTR1蛋白的降解［17－18］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，順鉑耐藥的人食管鱗癌細胞CTR1蛋白表達較其親代細胞有明顯的降低，這可能是耐藥細胞胞內(nèi)順鉑蓄積，以及Pt-DNA加合物減少的重要原因。然而，抗性細胞CTR1蛋白下調(diào)的機制并不明確。此外，銅離子螯合物和蛋白酶抑制劑能否恢復(fù)順鉑耐藥細胞已下調(diào)的CTR1蛋白水平，從而逆轉(zhuǎn)耐藥細胞對順鉑的抵抗性?這些問題值得進一步地研究探討。

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