一種純化蘇云金桿菌Cry1Ac蛋白的方法

王發(fā)祥，劉永樂，丁學(xué)知，夏立秋

（1.長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，長沙 410114；2.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物分子生物學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410081)

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）是世界上應(yīng)用范圍最廣的殺蟲微生物，其殺蟲活性主要來源于芽胞形成過程中產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白。蘇云金桿菌毒蛋白的殺蟲機(jī)理已基本明確，描述如下：晶體蛋白被敏感昆蟲吞食后，在堿性的中腸環(huán)境中很快被蛋白酶激活為活性毒素，然后結(jié)合到中腸上皮細(xì)胞的特異受體上，毒素隨后發(fā)生構(gòu)象變化并插入中腸膜，形成離子通道的孔，暴露在毒素中的中腸上皮細(xì)胞由于滲透平衡破壞而最終裂解死亡，并導(dǎo)致蟲體的死亡[1-2]。目前，對蘇云金桿菌Cry毒蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究已成為一個(gè)熱點(diǎn)，但國內(nèi)在相關(guān)領(lǐng)域的研究，受Cry蛋白的純化技術(shù)的制約，遠(yuǎn)落后于國際水平。

Cry蛋白是蘇云金桿菌在芽胞形成期產(chǎn)生的一種伴胞晶體蛋白，只有活化后才具有特異的殺蟲活性，其原毒素通常和20 kb DNA結(jié)合在一起[3]，因此很難用分子篩層析純化。另外，我們發(fā)現(xiàn)，用離子交換層析也無法純化獲得Cry蛋白原毒素，這很可能與Cry蛋白和20 kb DNA分子表面電荷分布復(fù)雜有關(guān)。基于此，我們提出了一種以等電點(diǎn)沉淀法純化Cry1Ac蛋白原毒素，進(jìn)而用分子篩層析純化其活性的毒素片段的方法，為進(jìn)一步研究Cry蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

BH-2型顯微鏡（日本Olympus公司）；AKTA purifier 100 system（美國 GE Healthcare）；DYY－Ⅲ－6B型電泳儀（北京六一儀器廠）；EY-1型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝科器研究所）。

胰蛋白酶（trypsin）、苯甲基磺酰氟（PMSF）和二硫蘇糖醇（DTT）均購自美國Amresco公司；其它試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分裝分析純。

1.2 質(zhì)粒和菌株

質(zhì)粒pHTAc35[4]為含有cry1Ac5（Genbank登錄號(hào)：M73248）全長的pHT315重組質(zhì)粒，由本室構(gòu)建；菌株BUAcHT35[4]為含有質(zhì)粒pHTAc35的 Cry-B重組菌，產(chǎn)典型菱形晶體，為本室構(gòu)建保存。

1.3 液體雙相法提純伴孢晶體

將菌株BUAcHT35接種于G-tris培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min培養(yǎng)至晶體和芽胞從母體細(xì)胞中完全釋放。收集發(fā)酵液，10 000 r/min離心10 min，沉淀，用0.5 mol/L NaCl洗滌3次，以生理鹽水制成懸液，超聲波處理（工作 30 s，間隙 30 s，20次），使晶體、芽胞、細(xì)胞碎片盡量分散；10 000 r/min離心10 min，收集沉淀，以生理鹽水洗滌2次；然后制成濃度為70 mg/mL（沉淀/雙蒸水）的懸液，用磁力攪拌器反復(fù)攪勻，同時(shí)不停地除去產(chǎn)生的泡沫，當(dāng)懸液中的泡沫不再增加時(shí)，轉(zhuǎn)入分液漏斗，按7∶6∶7的比例分別加入1%Na2SO4和CCl4，充分振蕩10 min后，靜置10 min；吸出上層水相，10 000 r/min離心10 min，沉淀用5%丙酮和雙蒸水各洗滌3次，所得沉淀即為提純的伴孢晶體，凍干備用。

1.4 等電點(diǎn)沉淀法純化原毒素

稱取10 mg凍干的晶體，加入10 mL 50 mmol/L 的 Na2CO3/NaHCO3緩沖液（pH 值 10.5），100 μL 100 mmol/L的DTT和終濃度為10 mmol/L的PMSF，4℃溶解 5 h后 12 000 r/min離心 1 min，棄不溶物；上清液用2 mol/L的醋酸/醋酸鈉緩沖液（pH 值 4.0） 調(diào)節(jié) pH 值分別至 4.55、4.65、4.75、4.85、4.95、5.05，置于 4℃環(huán)境下沉淀過夜，離心（13 200 r/min，10 min）收集沉淀，重懸浮于等量50 mmol/L的Na2CO3/NaHCO3（pH值9.5）緩沖液中，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.5 分子篩層析純化核心毒素

上述等電點(diǎn)沉淀純化的原毒素，加入500 μL 50 mmol/L的Na2CO3/NaHCO3緩沖液（pH值9.5）重懸浮，超聲波處理5s后按體積比50∶1加入10 μg/μL胰蛋白酶，37℃振蕩1～2 h；然后在 AKTA purifier 100純化系統(tǒng)中以superdex 200分子篩層析柱進(jìn)行層析純化，洗脫液為50 mmol/L的Na2CO3/NaHCO3（pH值10.5），洗脫流速為0.5 mL/min，上樣體積為0.5 mL，收集主要的峰部分進(jìn)行SDS-PAGE檢測，目的峰收集部分即為純化的毒素核心片段。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cry1Ac5原毒素的純化

Cry1Ac5蛋白的理論等電點(diǎn)（pI）為5.05，為了確定實(shí)際操作中Cry1Ac蛋白的真實(shí)等電點(diǎn)，將晶體溶解后調(diào)成系列pH值，用SDS-PAGE分析所得沉淀和上清液，結(jié)果如圖1。

圖1 不同的pH值下Cry1Ac原毒素的純化效果

如圖1所示，在pH值4.65～5.15，沉淀中都含有130 kDa蛋白條帶，而上清液中則沒有檢測到相應(yīng)條帶，說明在該pH值范圍，原毒素都會(huì)沉淀，且隨著pH值上升，沉淀中檢測到的130 kDa蛋白信號(hào)逐漸加強(qiáng)，pH值5.05時(shí)，蛋白條帶最粗，因此5.05應(yīng)為Cry1Ac3蛋白原毒素等電點(diǎn)沉淀的最佳pH值，與其理論等電點(diǎn)一致。此外，以等電點(diǎn)沉淀法純化的原毒素幾乎沒有雜蛋白，純化效果較好，但與晶體溶解后的上清液相比，其蛋白含量有較大的損失。

2.2 分子篩層析純化毒素活性片段

將等電點(diǎn)沉淀的原毒素以胰蛋白酶活化后，以AKTA purifier 100純化系統(tǒng)進(jìn)行分子篩層析，如層析圖譜（圖2A）所示，在洗脫時(shí)間15 min和30 min時(shí)，有兩個(gè)典型的峰，其中第1個(gè)峰在波長260 nm下的紫外吸收值大于波長280 nm下的吸收值，可能為結(jié)合在晶體蛋白上的DNA；第2個(gè)峰在280 nm下的紫外吸收值大于波長260 nm下的吸收值，應(yīng)該為目的蛋白峰。收集峰1和峰2進(jìn)行SDSPAGE檢測（圖2B），發(fā)現(xiàn)峰1對應(yīng)的泳道沒有蛋白條帶，后經(jīng)瓊脂糖電泳證實(shí)其主要成分為20kb DNA (數(shù)據(jù)未列出)，峰2對應(yīng)的泳道僅有一條60 kDa左右的蛋白條帶，即為活化的毒素核心片段，且純化效果較好。另外，洗脫時(shí)間35 min后還出現(xiàn)了一個(gè)較大的非典型峰，可能為活化過程中降解成的小分子肽片段，實(shí)驗(yàn)中沒有收集和檢測。

圖2 AKTA purifier 100純化圖譜（A）和SDS-PAGE分析（B）

3 討 論

Cry1Ac毒蛋白是目前所知的對鱗翅目昆蟲毒性最高和研究最多的Bt毒素之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、森林管理及水生態(tài)系統(tǒng)中都具有廣泛的應(yīng)用[5]。目前，在Bt毒素命名委員會(huì)網(wǎng)站中公布的Cry1Ac蛋白共23種，即Cry1Ac1～Cry1Ac23，Cry1Ac5為其中一種，含有1177個(gè)氨基酸，原毒素理論分子量為133 kDa，被昆蟲吞食后在其中腸中被蛋白酶裂解掉C-端566多個(gè)氨基酸和N-端的33個(gè)氨基酸，激活為65 kDa左右的核心毒素。目前，Cry1Ac蛋白的三維結(jié)構(gòu)尚未通過晶體衍射法完全明確，但研究發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)域Ⅲ比較特殊，與其它所有Cry1類蛋白的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)[6]。研究Cry1Ac蛋白的結(jié)構(gòu)與功能一直是當(dāng)前的熱點(diǎn)，因而獲得純化的Cry1Ac蛋白尤為重要。

根據(jù)不同的研究目的，Cry1Ac蛋白的純化涉及到伴孢晶體、原毒素和活性毒素的純化。伴孢晶體提純可采用液體雙相法和Mg2+梯度離心法[7]等；原毒素由于和20 kb DNA緊密結(jié)合，無法以層析等方法純化，目前鮮有純化的相關(guān)研究；另外，現(xiàn)有的報(bào)道幾乎都是以分子篩層析方法純化活性毒素，但由于大多以晶體溶解液直接活化，純化后還需要用超濾濃縮離心管進(jìn)行濃縮[8]。本文用液體雙相法提純伴孢晶體后，將其溶解在含有還原劑DTT的Na2CO3/NaHCO3緩沖液（pH 值10.5），調(diào)節(jié) pH 值至5.05進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，獲得純化的原毒素，將其重懸浮于Na2CO3/NaHCO3緩沖液（pH值9.5），用胰蛋白酶激活后進(jìn)行superdex 200分子篩柱層析，收集其最大峰即為純化的活性毒素。本方法不僅純化效果好，而且對原毒素進(jìn)行了濃縮，故以此為基礎(chǔ)通過分子篩層析純化的活性毒素可直接用于分析和功能研究實(shí)驗(yàn)，省去了超濾離心濃縮步驟。這是Cry蛋白的純化方法研究中的一次革新，對推動(dòng)Cry蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究具有重要的意義。

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