內(nèi)切酶與端肽酶水解牛乳酪蛋白的研究

丁 勇，孔 芳，衣杰榮，包建強(qiáng)

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

牛乳中含有大量的蛋白質(zhì)，其含量約為牛乳的3.3～3.5%，主要有酪蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白、乳鐵蛋白和一些具有重要生理功能的酶類(lèi)。酪蛋白在牛乳中占蛋白質(zhì)總量的80%～82%，并且酪蛋白中含有人體必需的8種氨基酸，是一種全價(jià)蛋白質(zhì)（PER值為2.5），能夠?yàn)樯矬w生長(zhǎng)發(fā)育提供必需的氨基酸。酪蛋白水解后，可離出多種活性物質(zhì)，按其功能分為：降血壓肽、抗血栓肽、免疫活性肽、促進(jìn)礦物離子吸收肽、抗菌肽等[1-2]。用酶法水解酪蛋白具有條件緩和、環(huán)境適宜和不破壞營(yíng)養(yǎng)等好處，是蛋白質(zhì)水解技術(shù)開(kāi)發(fā)研究的方向。但在水解后，蛋白質(zhì)經(jīng)酶水解得到的多肽往往帶有較明顯的苦味，限制了其在食品中的應(yīng)用。應(yīng)用游離的疏水性氨基酸無(wú)明顯的苦味的特性，用外切酶將位于端基的疏水性氨基酸殘基切下，可有效的減少水解液中的苦味。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛乳酪蛋白（上海貝基生物科技有限公司，蛋白質(zhì)含量實(shí)測(cè)值為 81.2%）；Alcalase 2.4 L和Flavourzyme（丹麥諾維信公司）；1 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（自配）；中性甲醛溶液（自配）。AL204電子天平（上海梅特勒-托利多公司）；HWS12型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；FE20精密pH計(jì)（上海梅特勒-托利多公司）；磁力攪拌器；離心機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Alcalase 2.4 L水解牛乳酪蛋白水解度的測(cè)定 水解度的測(cè)定采用pH-stat滴定法[3-4]。

1.2.2 Alcalase 2.4 L水解牛乳酪蛋白優(yōu)化設(shè)計(jì)影響酪蛋白水解度的因素主要有：A底物濃度，B水解介質(zhì)的pH值，C溫度和D加酶量。筆者用磷酸鹽緩沖液作為溶媒，考察底物濃度、pH值、溫度及加酶量對(duì)枯草桿菌堿性蛋白酶水解牛乳酪蛋白的影響，以水解度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。該試驗(yàn)采用正交表L9（34）安排試驗(yàn)，試驗(yàn)因素和水平的選擇如表1所示。

表1 Alcalase水解牛乳酪蛋白正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.3 Flavourzyme酶解牛乳酪蛋白Alcalase 2.4 L水解液的優(yōu)化設(shè)計(jì) 本研究選A：pH值，B：酶量（μL），C 溫度（℃），D 時(shí)間（h），用中性甲醛滴定法[3]以滴定中消耗堿的量作為評(píng)價(jià)Flavourzyme酶解牛乳酪蛋白的程度，選用L16（44）正交表安排試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2。

表2 Flavourzyme酶解正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.4 苦味評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5-6]稱(chēng)取奎啉0.1 g溶于50 mL 5%乙醇溶液中，從中取5 mL溶液用蒸餾水稀釋到100 mL，得到1.0×10-4g/mL等濃度的奎啉溶液，再進(jìn)一步稀釋成 5.0×10-5、2.5×10-5、1.0×10-5、5.0×10-6g/mL等濃度的奎啉溶液，其苦味值分別定為 10.0、5.0、2.5、1.0、0.5，將制得的多肽溶液與不同濃度奎啉溶液比較，從而確定多肽的苦味值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Alcalase 2.4 L酶解牛乳酪蛋白

研究按照Alcalase 2.4 L水解牛乳酪蛋白優(yōu)化設(shè)計(jì)的方案，選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 Alcalase酶解牛乳酪蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果

如表3所示，通過(guò)直觀分析法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果作了分析。經(jīng)過(guò)對(duì)極差分析和比較（B>A>C>D）可以看出：各因素對(duì)Alcalase酶水解酪蛋白水解度的影響主次順序依次為B、A、C、D，表明溶媒的pH值對(duì)酪蛋白的水解度影響最大，其次依次是底物濃度、溫度、加酶量。根據(jù)表3中K1、K2、K3值的大小確定各因素的最優(yōu)水平組合為A1B3C3D2，即試驗(yàn)的最佳水解條件為：底物濃度2%、pH值8.5、溫度為55℃、加酶量為 20 μL。

2.2 Flavourzyme酶解牛乳酪蛋白Alcalase 2.4 L水解液

本研究選 A：pH 值，B：酶量（mL），C溫度（℃），D時(shí)間（h），用中性甲醛滴定法以滴定中消耗堿的量作為評(píng)價(jià)Flavourzyme酶解牛乳酪蛋白的程度，選用L16（44）正交表安排試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

如表4所示，通過(guò)直觀分析法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果作了分析。經(jīng)過(guò)對(duì)極差分析和比較（B＞D＞C＞A）可以看出：各因素對(duì)Flavourzyme酶解牛乳酪蛋白的影響主 次 順 序 依 次 為 B、D、C、A， 即 加 酶 量 對(duì)Flavourzyme酶解影響最大，其次依次是時(shí)間、溫度、pH 值。根據(jù)表4 中 K1、K2、K3、K4值的大小確定各因素的最優(yōu)水平組合為A3B3C1D3，即試驗(yàn)的最佳酶解條件為：pH值6.5、加酶量為120 μL、溫度為55℃、時(shí)間 3 h。

表4 Flavourzyme酶解正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 苦味值評(píng)價(jià)結(jié)果

首先評(píng)價(jià)單一使用Alcalase 2.4 L的苦味值，苦味值較明顯，根據(jù)評(píng)定，苦味值為5。隨后隨著風(fēng)味蛋白酶的加入水解完成后水解液的苦味有了大幅度的降低，根據(jù)評(píng)定水解液的苦味值降至2.5。風(fēng)味蛋白酶是一種內(nèi)切酶和外切酶的混合酶，能夠有效地將疏水性氨基酸從多肽端切除，降低多肽的苦味。

3 結(jié) 論

在酪蛋白水解過(guò)程中，pH值可能影響中間絡(luò)合物的解離狀態(tài)，不利于催化生成產(chǎn)物。由于Alcalase 2.4 L酶水解酪蛋白過(guò)程中溶液是由堿性至酸性變化的，所以保持pH值恒定對(duì)于酶水解反應(yīng)至關(guān)重要。

加入風(fēng)味蛋白酶后水解液的pH值無(wú)明顯變化，用pH-stat法計(jì)算得到水解液的水解度幾乎不變。后來(lái)改用測(cè)定氨基氮含量的方法反映水解度的變化，結(jié)果表明了隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解液中氨基氮含量明顯呈上升趨勢(shì)。同時(shí)，蛋白質(zhì)水解液的苦味值得到大幅度降低。離心后得到的蛋白質(zhì)水解液具有水解度高，透明澄清，低苦味的特點(diǎn)。為下一步功能肽的分離制備奠定了基礎(chǔ)。

[1] 李小暉.牛乳中酪蛋白的結(jié)構(gòu)特性及其應(yīng)用[J].食品工業(yè)，2002，（1）：29-31.

[2] 孔 芳，衣杰榮，丁 勇.枯草桿菌蛋白酶水解牛乳酪蛋白的條件研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，（6）：9-11.

[3] Adler Nissen.Enzymic Hydrolysis of Food Proteins[M].London:Elsevier Applied Science Publishers,1986.116-124.

[4] 袁 斌，呂桂善，劉小玲.蛋白質(zhì)水解度的簡(jiǎn)易測(cè)定方法[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2002，（2）：113-115.

[5] 趙新淮.大豆水解物水解度測(cè)定的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，26（2）：178-181.

[6] 吳建中，趙謀明，寧正祥，等.雙酶法生產(chǎn)低苦味大豆多肽研究[J].食品工業(yè)科技，2003，（4）：24-26.