• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    豬繁殖和呼吸綜合征病毒GP3蛋白糖基化位點(diǎn)突變株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析

    2011-06-08 07:03:10劉歡歡周艷君姜一峰張善瑞童光志
    關(guān)鍵詞:糖鏈糖基化滴度

    劉歡歡,周艷君,姜一峰,張善瑞,童光志

    (中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241)

    豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種以母豬繁殖障礙、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎,仔豬發(fā)熱、呼吸困難、腹瀉、消瘦及高死亡率為特征的疾病[1]。2006年爆發(fā)的由豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株引起的“豬高熱綜合癥”更是對(duì)中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失,至今仍是影響中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)最重要的疾病之一[2-5]。

    PRRSV 為有囊膜的單股正鏈RNA病毒,基因組全長(zhǎng)約15 kb,含有9個(gè)開放閱讀框。ORF2-ORF7 分別編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白 GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、M 和 N。其中 GP5、M、N 為主要結(jié)構(gòu)蛋白[6];GP2a、GP3、GP4、GP5為糖基化的囊膜蛋白。GP3 是 PRRSV 中糖基化程度最高的蛋白, 歐洲型和北美洲型 PRRSV之間, GP3 的氨基酸同源性為54%~60%[7]。分析預(yù)測(cè)顯示GP3蛋白含有7個(gè)糖基化位點(diǎn),這些糖基化位點(diǎn)在不同毒株間均很保守[8]。GP3 與 GP2a 與 GP4 形成異源三聚體包裝入病毒粒子,缺失這三種蛋白的病毒粒子會(huì)失去感染性[9]。

    病毒的糖基化與病毒對(duì)細(xì)胞的吸附,病毒在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)及免疫原性等密切相關(guān)。經(jīng)過(guò)糖基化修飾的蛋白在病毒感染時(shí)能介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞融合(如副粘病毒的F蛋白),而且某些特定位點(diǎn)的糖基化與副粘病毒蛋白的生物活性密切相關(guān)[10]。糖基化修飾還能使病毒某些重要的抗原表位被糖鏈遮蓋,引起病毒的免疫逃逸現(xiàn)象,如人免疫缺陷病毒的 gp120 糖蛋白,因糖基化位點(diǎn)上的糖鏈遮蓋中和抗原表位導(dǎo)致中和抗體不能將其識(shí)別[11]。

    研究表明突變不同的糖基化位點(diǎn),會(huì)對(duì)病毒的拯救以及病毒在細(xì)胞上的生長(zhǎng)造成影響。關(guān)于GP3 蛋白糖基化的研究中,2007年有報(bào)道證實(shí),PRRSV FL12株GP3蛋白中有5個(gè)位點(diǎn)(N-29、N-50、N-131、N-152、N-160)是被糖鏈修飾的,而 N42 和 N195 位不存在糖鏈,不是真正的糖基化位點(diǎn)[12]。 2010年,Das 等[13]研究指出 GP3 蛋白的 N195 位點(diǎn)沒(méi)有糖鏈;N42A、N50A 或 N131A單個(gè)位點(diǎn)的突變都不能拯救出病毒,意味著這幾個(gè)糖基化位點(diǎn)對(duì)病毒粒子的形成來(lái)說(shuō)是必須的;N29A、N152A或N160A位點(diǎn)的突變不影響感染性病毒粒子的產(chǎn)生;對(duì)GP3糖基化位點(diǎn)進(jìn)行多點(diǎn)突變顯示,N29A/N152A、N29A/N160A、N152A/N160A、N29A/N152A/N160A多點(diǎn)突變后的 cDNA克隆都能拯救出病毒,但對(duì)生長(zhǎng)速度有影響,其中N29A/N152A/N160A突變病毒與只含兩點(diǎn)突變的毒株相比,生長(zhǎng)更為緩慢并且滴度降低。 2011年Vu等[14]證實(shí)GP3的N131糖基化位點(diǎn)與GP5上的糖基化位點(diǎn)起著相同的作用,即保護(hù)病毒逃避宿主的中和抗體。

    GP3蛋白的糖基化位點(diǎn)在不同亞型的毒株中均保守,因此對(duì)其糖基化位點(diǎn)的研究具有普遍意義。本實(shí)驗(yàn)選取高致病性 PRRSV 的致弱毒株HuN4-F112[15]GP3蛋白的5個(gè)N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行單位點(diǎn)和多位點(diǎn)進(jìn)行去糖基化改造,在全長(zhǎng)感染性克隆的基礎(chǔ)上拯救病毒,通過(guò)拯救病毒生物學(xué)特性的變化來(lái)探究這些糖基化位點(diǎn)的作用。

    1 材料與方法

    1.1 毒株、菌株與抗體 PRRSV HuN4-F112株、BHK和MARC-145細(xì)胞、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、PRRSV 的N蛋白單抗[16]均有本實(shí)驗(yàn)室保存;HuN4-F112株感染性分子克隆由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及保存[17];FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自中山金橋公司(北京)。

    1.2 試劑 RNA提取試劑盒購(gòu)于QIAGEN公司;體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion) 反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶Asc I和Swa I、dNTP混合物、DNA Marker等均購(gòu)自大連寶生物有限公司;PFX高保真聚合酶購(gòu)自Invitrogen公司。

    1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)HuN4-F112株GP3蛋白的基因序列,對(duì)其潛在糖基化位點(diǎn)進(jìn)行在線分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/),結(jié)果顯示該株GP3蛋白存在7個(gè)糖基化位點(diǎn)。用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)N29、N42、N50、N131位糖基化位點(diǎn)突變的引物,將預(yù)測(cè)位點(diǎn)中的氨基酸由N(AAT)突變?yōu)镼(CAG/CAA),同時(shí)設(shè)計(jì)ORF3片段鑒定引物(P3u/P3d)(見(jiàn)表1),所有引物均送由上海Invitrogen公司合成。

    1.4 突變?nèi)L(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建 引物中含有待突變的糖基化位點(diǎn),以質(zhì)粒為模板,采用環(huán)式定點(diǎn)PCR的方法進(jìn)行突變以獲得包含突變位點(diǎn)的雙鏈質(zhì)粒。將序列正確(已包含所需突變)的質(zhì)粒及F-112株全長(zhǎng)質(zhì)粒經(jīng)Asc I和Swa I雙酶切,電泳后凝膠回收,用T4 DNA連接酶將兩片段進(jìn)行連接。連接好的重組質(zhì)粒再經(jīng)酶切和序列分析鑒定,鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行線性化。本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的PRRSV HuN4-F112株感染性克隆在3'末端引入了SwaI酶切位點(diǎn),經(jīng)SwaI酶切后將包含全長(zhǎng)的質(zhì)粒由環(huán)狀變?yōu)榫€性以備轉(zhuǎn)染。

    表1 糖基化位點(diǎn)突變引物及鑒定引物Table 1 Primers for mutation of glycosylation sites and sequence qualification

    1.5 病毒的拯救

    1.5.1 體外轉(zhuǎn)錄 按照體外轉(zhuǎn)錄試劑盒mMessage High Yield Capped RNA Taanscription kit 說(shuō)明,對(duì)已線性化的質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

    1.5.2 轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d預(yù)先準(zhǔn)備好BHK細(xì)胞,將細(xì)胞鋪入六孔板內(nèi)。按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明,待細(xì)胞密度達(dá)到70%~90%,用DMRIE-C試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。先將鋪好的細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌3次,取12 μL DMRIE-C試劑加入到1 mL OPTI-MEM的EP管中,混勻后加入2.5~5 μg轉(zhuǎn)錄好的RNA,混勻后立即加入到洗滌過(guò)的細(xì)胞中,然后置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后吸出培養(yǎng)液,再加入2%~3%FBS的細(xì)胞維持液。24 h后收取細(xì)胞,-80℃保存。所有突變克隆均經(jīng)3次轉(zhuǎn)染。

    1.5.3 病毒傳代 病毒傳代前1 d,預(yù)先將MARC-145細(xì)胞鋪入六孔板內(nèi)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層,取凍溶后的BHK-21細(xì)胞離心取上清接入六孔板內(nèi)。置于5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi),37 ℃孵育5 h后換2%~3%細(xì)胞的維持液。每5 d為一代次進(jìn)行拯救病毒傳代培養(yǎng),傳至第5代收取病毒。

    1.6 拯救病毒的鑒定

    1.6.1 間接免疫熒光 轉(zhuǎn)染72 h后,棄去維持液培養(yǎng)基。用冰甲醇固定10 min,1%BSA室溫封閉30 min,用PRRSV的N蛋白特異性單抗37 ℃孵育2 h,PBS洗3遍后再加入FITC標(biāo)記羊抗鼠的二抗,37 ℃避光孵育1 h,用PBS洗5遍后,在倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果,并拍照。

    1.6.2 重組病毒序列測(cè)定 將拯救的病毒提取RNA反轉(zhuǎn)錄后,用P3u/P3d引物擴(kuò)增GP3蛋白相應(yīng)片段,目的條帶凝膠電泳后回收與T載體連接,挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

    1.7 拯救病毒的生物學(xué)分析

    1.7.1 拯救病毒TCID50的測(cè)定 將待檢樣品用培養(yǎng)液做10倍系列稀釋后,將稀釋度為10-1到10-10連續(xù)稀釋的病毒接種到鋪好并長(zhǎng)至單層的Marc-145細(xì)胞96孔培養(yǎng)板內(nèi)。每個(gè)稀釋度接種8孔,即做8個(gè)重復(fù),同時(shí)設(shè)兩組陰性對(duì)照(用維持液代替病毒液)。置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育,每隔12 h觀察細(xì)胞,記錄CPE情況。 結(jié)果依據(jù)Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

    1.7.2 細(xì)胞病變的觀察 將拯救的病毒及親本毒株以1MOI感染MARC-145細(xì)胞,48 h后觀察細(xì)胞病變情況。

    1.7.3 生長(zhǎng)曲線的繪制 拯救病毒以0.1MOI感染MARC-145細(xì)胞,分別在感染后12、24、36、48、60、72、84、96 h收取100μL細(xì)胞上清液,用半數(shù)感染量(TCID50)計(jì)算病毒滴度,根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)病毒的滴度繪制病毒多步生長(zhǎng)曲線。

    2 結(jié)果

    2.1 拯救PRRSV的鑒定 在構(gòu)建HuN4-F112病毒感染性分子克隆時(shí),曾將基因組第14 680位的A沉默突變?yōu)镚,產(chǎn)生一個(gè)Mlu I酶切位點(diǎn)作為鑒定拯救病毒的分子標(biāo)記。在本實(shí)驗(yàn)中,根據(jù)此酶切位點(diǎn)前后區(qū)域序列設(shè)計(jì)引物,以拯救出來(lái)的突變體病毒RNA作為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Mlu I酶切鑒定。結(jié)果顯示拯救出來(lái)的PRRSV均為HuN4-F112病毒感染性分子克隆衍生的毒株,而非野毒感染(圖1)。

    2.2 拯救PRRSV特異性RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 用PRRSV ORF5和Nsp2基因特異性引物對(duì)拯救出的五代病毒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示N29Q、N42Q、N50Q、N131Q、N29Q/N50Q、N29Q/N195Q突變體均為陽(yáng)性,N29Q/N42Q、N29Q/N131Q、N29Q/N50Q/N131Q、N29Q/N42Q/N50Q/N131Q/N195Q均為陰性(圖2)。

    2.3 序列測(cè)定結(jié)果 通過(guò)對(duì)拯救病毒RT-PCR分析,PCR產(chǎn)物連接到T載體后獲得單個(gè)克隆進(jìn)行序列測(cè)定,所得的6株病毒序列中GP3蛋白相應(yīng)位置糖基化位點(diǎn)均由N(AAT)變?yōu)镼(CAG),表明去糖基化突變成功(圖3)。

    2.4 間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果 將上述PCR及酶切鑒定正確的6株病毒用PRRSV N蛋白單抗進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè),結(jié)果顯示在六株拯救病毒中均可見(jiàn)強(qiáng)烈熒光(圖4)。

    2.5 細(xì)胞病變 拯救病毒以1MOI接種MARC-145細(xì)胞,48 h后觀察細(xì)胞病變,除N50Q外均可見(jiàn)細(xì)胞存在崩解、脫落、形態(tài)不規(guī)則等典型細(xì)胞病變(圖5)。細(xì)胞病變結(jié)果與親本HuN4-F112株引起的細(xì)胞病變基本一致。

    2.6 拯救病毒的滴度 采用96孔組織培養(yǎng)板方法對(duì)第五代拯救病毒進(jìn)行感染性滴度的測(cè)定。10倍梯度稀釋病毒原液(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9)后接種 MARC-145 細(xì)胞,結(jié)果用Reed-Muench法計(jì)算后如表2。

    圖4 PRRSV N蛋白間接免疫熒光檢測(cè)拯救病毒結(jié)果Fig.4 Identification of the rescued viruses with monoclonal antibody against N protein of PRRSV

    圖5 拯救病毒接種MARC-145細(xì)胞48 h后出現(xiàn)細(xì)胞病變Fig.5 The CPE of MARC-145 cells 48 hours after infected with rescued viruses

    表2 拯救病毒的TCID50Table 2 TCID50 of the rescued viruses

    2.7 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 96孔組織培養(yǎng)板方法進(jìn)感染滴度的測(cè)定,取拯救毒株及HuN4-F112株不同時(shí)段的病毒上清液,測(cè)得的半數(shù)細(xì)胞感染量繪制成生長(zhǎng)曲線(圖7)。結(jié)果顯示拯救的N42Q、N29Q、N29Q/N195Q在生長(zhǎng)趨勢(shì)上與HuN4-F112株存在一個(gè)多滴度的差別, 而N50Q株感染至48 h才出現(xiàn)病變,較親本毒株生長(zhǎng)明顯延遲。

    3 討論

    病毒的囊膜糖蛋白通常具有抗原性,可以選擇性地識(shí)別宿主細(xì)胞受體并與之結(jié)合,使病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜融合,進(jìn)而侵入宿主細(xì)胞[18]。如流感病毒HA蛋白能識(shí)別宿主細(xì)胞表面的糖鏈?zhǔn)荏w,糖鏈末端的唾液酸是流感病毒的結(jié)合位點(diǎn)[19,20],通過(guò)這種識(shí)別和結(jié)合,病毒得以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)增殖。本實(shí)驗(yàn)中拯救的六株病毒TCID50均低于親本毒株,并且以單點(diǎn)突變株N50Q滴度變化最大,所有拯救突變體病毒生長(zhǎng)曲線較母本毒株也均有較大差異,一種可能的解釋就是糖基化位點(diǎn)的消失改變了囊膜蛋白GP3上受體識(shí)別位點(diǎn)的構(gòu)象,使病毒與宿主細(xì)胞的融合及進(jìn)入細(xì)胞的效率和能力降低,導(dǎo)致病毒的滴度下降。

    2007年有研究指出美洲型PRRSV FL12株GP3蛋白的N42、N50、N131位糖基化位點(diǎn)突變的cDNA克隆無(wú)法拯救出活病毒,證明這些位點(diǎn)對(duì)病毒粒子的形成至關(guān)重要,然而在本實(shí)驗(yàn)中這三個(gè)糖基化位點(diǎn)均可以拯救出病毒,與以往報(bào)道有所不同。GP3蛋白的7個(gè)糖基化位點(diǎn)在兩種基因型的PRRSV之間均非常保守,但這三個(gè)位點(diǎn)在不同亞型的毒株間作用不盡相同,可見(jiàn)糖鏈在病毒蛋白的生物學(xué)功能的發(fā)揮中起著復(fù)雜而獨(dú)特的作用。

    從拯救病毒的滴度和生長(zhǎng)趨勢(shì)的分析中發(fā)現(xiàn):拯救病毒(除N131Q外)的TCID50較親本毒株有所降低,多步生長(zhǎng)曲線中各時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)趨勢(shì)也呈下降趨勢(shì),其中N42Q、N29Q、N29Q/N195Q突變體比母源毒均下降1個(gè)滴度以上,N29Q/N50Q下降約2個(gè)多滴度,而N50Q突變體與親本毒株相比下降近6個(gè)滴度;拯救出的兩個(gè)糖基化位點(diǎn)突變體與單位點(diǎn)突變體病毒滴度上差異不顯著,拯救病毒N29Q/N50Q的滴度反而高于N50Q,可見(jiàn)29、50兩個(gè)單點(diǎn)突變與29/50、29/195兩個(gè)糖基化位點(diǎn)同時(shí)突變相比病毒滴度沒(méi)有明顯差別; N50Q病毒的生長(zhǎng)趨勢(shì)較親本株差異顯著,該株病毒感染48 h后才開始出現(xiàn)細(xì)胞病變,與親本株48 h后達(dá)到滴度高峰相比生長(zhǎng)明顯延遲,推測(cè)N50位糖基化位點(diǎn)在病毒對(duì)細(xì)胞的侵入及病毒粒子的形成中發(fā)揮著重要作用。

    在本研究中一個(gè)值得注意的現(xiàn)象是針對(duì)單個(gè)位點(diǎn)的突變株均能拯救出病毒,但將多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變有些則無(wú)法拯救出病毒。糖基化位點(diǎn)N29Q和N42Q單位點(diǎn)突變后病毒均能成功拯救,而N29Q/N42Q同時(shí)突變則不能拯救出病毒。同樣,N29Q、N131Q位糖基化位點(diǎn)單個(gè)突變均能獲得病毒,同時(shí)突變這兩個(gè)位點(diǎn)則不能,這一現(xiàn)象也發(fā)生在將N29Q、N50Q、N131Q三個(gè)糖基化位點(diǎn)同時(shí)突變對(duì)病毒的拯救中。對(duì)無(wú)法拯救出病毒的質(zhì)粒序列測(cè)定,除相應(yīng)突變的糖基化位點(diǎn)存在改變外,其他序列與親本株一致。一種可能的推測(cè)是在PRRSV中GP3蛋白中也可能存在一個(gè)糖基化位點(diǎn)的變化影響著另一個(gè)位點(diǎn)糖鏈的修飾,一個(gè)位點(diǎn)的改變通過(guò)空間位阻效應(yīng)影響著其它位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和被修飾的形式,從而導(dǎo)致整個(gè)蛋白糖基化種類的變異以致生物學(xué)功能發(fā)生改變。另一種可能是單個(gè)糖基化位點(diǎn)對(duì)病毒的影響是相對(duì)微弱的,改變這一位點(diǎn)的構(gòu)象,其他位點(diǎn)會(huì)發(fā)揮代償性作用,所以單個(gè)糖基化位點(diǎn)不具有決定性。但多個(gè)糖基化位點(diǎn)同時(shí)突變導(dǎo)致病毒的蛋白包裝、折疊、修飾等加工過(guò)程改變,這種改變是多點(diǎn)同時(shí)變化造成的,沒(méi)有其它位點(diǎn)代償性機(jī)能的發(fā)揮。最終會(huì)使病毒無(wú)法識(shí)別和結(jié)合受體,不能將病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜融合等,從而使病毒喪失了產(chǎn)生子代的能力。

    本研究著眼于次要結(jié)構(gòu)蛋白GP3,發(fā)現(xiàn)分別突變?cè)摰鞍咨螻29Q、N42Q、N50Q、N131Q位糖基化位點(diǎn)突變都能拯救出病毒,但是會(huì)影響病毒在MARC-145細(xì)胞上的生長(zhǎng),且N50Q位突變對(duì)病毒影響最大。同時(shí)突變兩個(gè)以上位點(diǎn)則不能拯救出病毒,可見(jiàn)多個(gè)糖基化位點(diǎn)的同時(shí)存在對(duì)產(chǎn)生子代病毒粒至關(guān)重要。本研究闡釋了次要結(jié)構(gòu)蛋白GP3糖基化對(duì)病毒影響,希望能為后續(xù)研究糖基化對(duì)PRRS病毒粒子形成、致病性及免疫逃逸等方面的影響提供思路和依據(jù)。

    [1]Dea S, Gagnon C A, Mardassi H, et al. Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome ( PRRS)virus: Comparison of the North American and European isolates[J]. Arch Virol ,2000, 145(4): 659-688.

    [2]Tong G Z, Zhou Y J, Hao X F, et al. Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome, China[J].Emerg Infect Dis, 2007,13(9):1434-1436.

    [3]童光志, 周艷君, 郝曉芳, 等. 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學(xué)分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2007, 29(5): 323-327.

    [4]Tian K G, Yu X L, Zhao T Z, et al. Emergence of Fatal PRRSV Variants: Unparalleled Outbreaks of Atypical PRRS in China and Molecular Dissection of the Unique Hallmark [J]. PLoS One, 2007, 2(6): e526.

    [5]Zhou Y J, Hao X F, Tong G Z, et al. Highly Virulent Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Emerged in China[J].Transbound Emerg Dis, 2008, 55(3-4): 152-164.

    [6]Snijder E J, van Tol H, Pedersen K W, et al. Identification of a novel structural protein of arteriviruses [J]. J Virol,1999, 73(8): 6335-6345.

    [7]Meng X J, Paul P S, Halbur P G , et al. Sequence comparison of open reading frames 2 to 5 of low and high virulence United States isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J]. J Gen Virol, 1995, 76(Pt12): 3181-3188.

    [8]Gonin P, Pirzadeh B, Gagnon C A , et al. Sero neutralization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus correlates with antibody response to the GP5 major envelope glycoprotein[J]. J Vet Diag Invest, 1999, 11(1): 20-26.

    [9]Wissink E H, Kroese M V, van Wijk H A, et al. Envelope protein requirements for the assembly of infectious virions of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].J Virol, 2005, 79(19): 12495-12506.

    [10]MeGinnes L, Sergel T, Reitter J, et al. Carbohydrate Modifications of the NDV Fusion Protein Heptad Repeat Domains Influence Maturation and FusionActivity [J].Virology, 2001, 283 (2): 332 -342.

    [11]Wei X P, Decker J M, Wang S Y, et al. Antibody neutralization and escape by HIV-1[J]. Nature, 2003,422(6929):307-313.

    [12]Pattnaik A K. Enhancement of efficacy of PRRS vaccines by altering the glycosylation pattern of viral glycoproteins[R]. USA: University of Nebraska-Lincoln,2007.

    [13]Das P B, Vu H L X, Dinh P X, et al. Glycosylation of minor envelope glycoproteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in infectious virus recovery,receptor interaction, and immune response[J]. Virology,2011, 410(2): 385-394.

    [14]Vu H L, Kwon B, Yoon K J, et al. Immune evasion of porcine reproductive and respiratory syndrome virus through glycan shielding involves both glycoprotein 5 as well as glycoprotein 3 [J]. J Virol, 2011, 85(11): 5555-5564.

    [15]Tian Z J, An T Q, Zhou Y J, et al. An attenuated live vaccine based on highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV)protects piglets against HP-PRRS [J]. Vet Microbiol, 2009,138(1-2): 34-40.

    [16]周艷君. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白單克隆抗體的制備及其抗原表位的鑒定[D]. 哈爾濱: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005.

    [17]張善瑞.高致病性豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒及其弱毒株感染性克隆的構(gòu)建和應(yīng)用[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2010.

    [18]潘浩, 周迎會(huì), 吳士良. 糖基化與病毒[J]. 生命的化學(xué),2005(25): 26-29.

    [19]Suzuki Y, Kato H, Naeve C, et al. Single-aminoacid substitution in an antigenic site of influenza virus hemagglutinin can alter the specificity of binding to cell membrane-associated gangliosides[J]. J Virol, 1989,63(10): 4298 - 4302.

    [20]Ito T, Suzuki Y, Takada A, et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection [J]. J Virol, 1997, 71(4):3357-3362.

    猜你喜歡
    糖鏈糖基化滴度
    基于FFPE組織切片的膀胱癌N-連接糖鏈原位酶解及分析*
    不同富集培養(yǎng)方法對(duì)噬菌體PEf771的滴度影響
    重組腺相關(guān)病毒基因藥物三種滴度的比較與分析
    自身免疫性肝病診斷中抗核抗體與自身免疫性肝病相關(guān)抗體檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值
    精準(zhǔn)捕獲“糖鏈”有助揭示病毒侵染機(jī)制
    植物N-糖鏈檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展
    花生致敏糖蛋白Ara h1糖鏈決定簇的質(zhì)譜分析
    糖基化終末產(chǎn)物與冠脈舒張功能受損
    慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA,HBeAg和ALT滴度與恩替卡韋療效的關(guān)系
    油炸方便面貯藏過(guò)程中糖基化產(chǎn)物的變化規(guī)律
    极品教师在线视频| 少妇丰满av| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产成人freesex在线| 国产成人午夜福利电影在线观看| 久久久久久久国产电影| 精品人妻熟女av久视频| 能在线免费看毛片的网站| 免费大片18禁| 一级毛片久久久久久久久女| 久久久精品欧美日韩精品| 久久精品综合一区二区三区| 日韩av免费高清视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 99久久精品国产国产毛片| 男女视频在线观看网站免费| 舔av片在线| 亚洲国产欧美人成| 久久精品国产自在天天线| 只有这里有精品99| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲欧美精品自产自拍| 一个人看的www免费观看视频| 久久久久久久久久成人| 久久久久久久久中文| 丝袜喷水一区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产精品一二三区在线看| 男人和女人高潮做爰伦理| 九色成人免费人妻av| 国产精品一及| 国产黄片美女视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| kizo精华| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲av在线观看美女高潮| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲一区高清亚洲精品| 成人av在线播放网站| 高清欧美精品videossex| 午夜免费激情av| 久久午夜福利片| 一个人观看的视频www高清免费观看| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲av一区综合| 男女国产视频网站| 我要看日韩黄色一级片| 欧美另类一区| 久久综合国产亚洲精品| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 精品久久久久久久久av| 少妇的逼好多水| 一级a做视频免费观看| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲18禁久久av| 亚洲美女视频黄频| 久久这里只有精品中国| 精品久久久久久久久亚洲| 最新中文字幕久久久久| 少妇丰满av| 黄片wwwwww| 亚洲欧洲国产日韩| av免费在线看不卡| 97超视频在线观看视频| 日韩制服骚丝袜av| 日日撸夜夜添| 少妇的逼好多水| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 99热网站在线观看| 亚洲综合色惰| 久久久精品欧美日韩精品| 精品久久久久久久久av| 欧美精品国产亚洲| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产精品.久久久| 黄色一级大片看看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 免费人成在线观看视频色| 少妇的逼水好多| 高清视频免费观看一区二区 | 欧美人与善性xxx| 一级爰片在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 99久久人妻综合| av线在线观看网站| 亚洲精品一区蜜桃| 免费少妇av软件| 国产午夜精品一二区理论片| 国产伦一二天堂av在线观看| 色5月婷婷丁香| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 爱豆传媒免费全集在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 日本wwww免费看| 天堂√8在线中文| 精品一区在线观看国产| 丰满乱子伦码专区| 国产黄a三级三级三级人| 国产视频首页在线观看| 两个人视频免费观看高清| 大香蕉97超碰在线| av女优亚洲男人天堂| 男人狂女人下面高潮的视频| 99久久人妻综合| 欧美潮喷喷水| 久久久久久久久久成人| 国产精品1区2区在线观看.| 久久热精品热| 国产 一区精品| 高清日韩中文字幕在线| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲精品国产成人久久av| 国产av国产精品国产| 欧美成人a在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 精品人妻熟女av久视频| 99久国产av精品| 在线观看人妻少妇| 亚洲久久久久久中文字幕| 老女人水多毛片| 啦啦啦韩国在线观看视频| 内射极品少妇av片p| 大陆偷拍与自拍| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产免费福利视频在线观看| 国产精品一区二区性色av| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 草草在线视频免费看| 国产精品三级大全| 69av精品久久久久久| 大香蕉97超碰在线| 亚洲人与动物交配视频| 国产单亲对白刺激| 观看免费一级毛片| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲性久久影院| 熟女电影av网| 日韩av不卡免费在线播放| 最新中文字幕久久久久| 亚洲av成人av| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 久久国内精品自在自线图片| 国产美女午夜福利| 99热这里只有精品一区| 欧美高清成人免费视频www| 色网站视频免费| 午夜日本视频在线| 亚洲美女视频黄频| 欧美另类一区| 久久韩国三级中文字幕| 国产淫片久久久久久久久| 中文字幕亚洲精品专区| 欧美97在线视频| 网址你懂的国产日韩在线| 国产av码专区亚洲av| 亚洲av中文av极速乱| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 听说在线观看完整版免费高清| 好男人视频免费观看在线| 最近的中文字幕免费完整| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 久久精品国产亚洲av天美| 国产免费又黄又爽又色| 十八禁网站网址无遮挡 | 日韩视频在线欧美| 国产精品久久久久久久电影| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产亚洲最大av| 偷拍熟女少妇极品色| 乱系列少妇在线播放| 亚洲天堂国产精品一区在线| 熟女电影av网| 国产精品一区二区三区四区久久| 日本欧美国产在线视频| 国产日韩欧美在线精品| 精品国产露脸久久av麻豆 | 黄色欧美视频在线观看| 国产午夜精品一二区理论片| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 日本免费a在线| 91久久精品国产一区二区成人| 免费观看的影片在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产乱来视频区| 亚洲图色成人| 国产激情偷乱视频一区二区| 欧美最新免费一区二区三区| 国产亚洲5aaaaa淫片| 亚洲精品乱久久久久久| 青青草视频在线视频观看| 久久久久精品性色| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 色5月婷婷丁香| 国产精品一区二区性色av| 在线观看一区二区三区| 国产精品精品国产色婷婷| 男人和女人高潮做爰伦理| 直男gayav资源| 国产又色又爽无遮挡免| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 午夜福利在线在线| 精品久久久久久久久亚洲| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 人妻系列 视频| 成人综合一区亚洲| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲av福利一区| videossex国产| 中文字幕制服av| 国产午夜精品论理片| 精品人妻偷拍中文字幕| 97超视频在线观看视频| 国产视频首页在线观看| 亚洲四区av| 99热这里只有精品一区| 不卡视频在线观看欧美| 久久久久久九九精品二区国产| 国产成人免费观看mmmm| 日日干狠狠操夜夜爽| 免费看日本二区| 三级经典国产精品| 永久网站在线| 久久久久性生活片| 超碰av人人做人人爽久久| 国产精品1区2区在线观看.| 国产免费一级a男人的天堂| 久久久久久久久久人人人人人人| 夫妻午夜视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲国产欧美人成| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲av一区综合| 亚洲av不卡在线观看| 十八禁国产超污无遮挡网站| 色综合色国产| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 一边亲一边摸免费视频| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲人与动物交配视频| 天堂影院成人在线观看| 中文资源天堂在线| 亚洲成人中文字幕在线播放| 床上黄色一级片| 国产黄色视频一区二区在线观看| 99热这里只有精品一区| 99视频精品全部免费 在线| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲人成网站在线播| 午夜福利高清视频| 久久精品国产自在天天线| 亚州av有码| 深爱激情五月婷婷| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲精品第二区| 直男gayav资源| 国产成人freesex在线| 我的老师免费观看完整版| 久久这里只有精品中国| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 成年人午夜在线观看视频 | 国产精品99久久久久久久久| 亚洲在线自拍视频| 中文字幕av在线有码专区| 黄色配什么色好看| 免费无遮挡裸体视频| 18+在线观看网站| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲在线观看片| 国产伦在线观看视频一区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 91aial.com中文字幕在线观看| 久久久久久久久久黄片| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久久久网色| 亚洲久久久久久中文字幕| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产高潮美女av| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久久久久久大尺度免费视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 一个人看视频在线观看www免费| 日韩av不卡免费在线播放| 国产精品一及| 视频中文字幕在线观看| 午夜激情福利司机影院| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 老司机影院毛片| 久久这里只有精品中国| 卡戴珊不雅视频在线播放| 日韩一区二区三区影片| 波多野结衣巨乳人妻| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| av国产久精品久网站免费入址| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲国产最新在线播放| 一级爰片在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产不卡一卡二| 国产视频首页在线观看| 久久久久精品性色| 免费少妇av软件| 国产一级毛片七仙女欲春2| 美女国产视频在线观看| 国产精品久久视频播放| 欧美 日韩 精品 国产| 十八禁网站网址无遮挡 | 国产精品一区二区三区四区免费观看| 久久国产乱子免费精品| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 青春草国产在线视频| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲成人av在线免费| 国产不卡一卡二| 一级毛片我不卡| 亚洲美女搞黄在线观看| 黄色一级大片看看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 一级毛片久久久久久久久女| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲精品一二三| 91久久精品电影网| 中文欧美无线码| 天堂√8在线中文| 毛片女人毛片| 亚洲人成网站在线播| 免费看光身美女| 精品人妻视频免费看| 91久久精品国产一区二区三区| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 人人妻人人看人人澡| 在线观看av片永久免费下载| 床上黄色一级片| 亚洲欧美一区二区三区国产| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产精品久久久久久精品电影| 欧美zozozo另类| 中文字幕制服av| 国产又色又爽无遮挡免| 日韩精品青青久久久久久| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲国产色片| 亚洲图色成人| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲成人中文字幕在线播放| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产一级毛片在线| 精品酒店卫生间| 99热网站在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美3d第一页| 欧美+日韩+精品| 深夜a级毛片| 两个人视频免费观看高清| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲经典国产精华液单| 99久久中文字幕三级久久日本| 老司机影院成人| 成人欧美大片| 男女边摸边吃奶| 日韩成人av中文字幕在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 国产黄片美女视频| 亚洲怡红院男人天堂| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 国产精品一区二区性色av| 一边亲一边摸免费视频| 午夜激情欧美在线| 91精品一卡2卡3卡4卡| 哪个播放器可以免费观看大片| 日本av手机在线免费观看| 成人鲁丝片一二三区免费| 十八禁网站网址无遮挡 | 日本黄大片高清| 国产黄a三级三级三级人| 成人av在线播放网站| 免费人成在线观看视频色| 日韩av在线免费看完整版不卡| 久久久国产一区二区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 成人无遮挡网站| 亚洲精品国产成人久久av| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲成人久久爱视频| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲图色成人| 国产精品日韩av在线免费观看| 97超碰精品成人国产| 国产免费视频播放在线视频 | 国产淫语在线视频| 日日啪夜夜撸| 久久久久久久午夜电影| 国产亚洲一区二区精品| 免费av不卡在线播放| 亚洲18禁久久av| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 高清在线视频一区二区三区| 中文天堂在线官网| 一夜夜www| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产精品一二三区在线看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 午夜福利视频1000在线观看| 97超碰精品成人国产| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲国产色片| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产不卡一卡二| 男插女下体视频免费在线播放| 国产一区有黄有色的免费视频 | 2018国产大陆天天弄谢| 午夜激情欧美在线| 搞女人的毛片| 久久99热这里只有精品18| 国产亚洲精品久久久com| 久久久久久久久中文| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲国产精品成人久久小说| 丝袜喷水一区| 黄色日韩在线| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国内精品宾馆在线| 久久久久国产网址| 精品午夜福利在线看| 亚洲成人一二三区av| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 深爱激情五月婷婷| 成人一区二区视频在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲av成人精品一二三区| 99热全是精品| 高清午夜精品一区二区三区| 91在线精品国自产拍蜜月| 日韩欧美一区视频在线观看 | 一级片'在线观看视频| 伊人久久国产一区二区| 精品人妻视频免费看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国精品久久久久久国模美| 久久亚洲国产成人精品v| 少妇的逼好多水| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产av在哪里看| av女优亚洲男人天堂| 插逼视频在线观看| 国产高清有码在线观看视频| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 国产极品天堂在线| 精品一区二区三区视频在线| 国产高清不卡午夜福利| 日本免费a在线| 久久久精品免费免费高清| 精品久久久久久电影网| 国产一级毛片在线| av在线观看视频网站免费| 久99久视频精品免费| av福利片在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 日本三级黄在线观看| 国产av在哪里看| 亚洲四区av| .国产精品久久| 丝袜美腿在线中文| 欧美人与善性xxx| av在线天堂中文字幕| 免费看不卡的av| 夫妻午夜视频| 18禁动态无遮挡网站| 国产一区二区三区av在线| 六月丁香七月| 亚洲无线观看免费| 日韩精品有码人妻一区| 久久久久网色| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 免费av毛片视频| 免费在线观看成人毛片| 久久久久久久久久久免费av| 五月玫瑰六月丁香| 免费看日本二区| 国产精品久久久久久久电影| 综合色av麻豆| 久久久久久久久久久丰满| 男女啪啪激烈高潮av片| 久久6这里有精品| 一级爰片在线观看| 亚洲在久久综合| 在线观看av片永久免费下载| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 中文字幕制服av| 国产熟女欧美一区二区| 激情五月婷婷亚洲| 精品久久久久久成人av| 欧美xxⅹ黑人| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 直男gayav资源| 在线观看av片永久免费下载| 一夜夜www| 免费少妇av软件| 国产三级在线视频| 美女内射精品一级片tv| 国产探花极品一区二区| 深爱激情五月婷婷| 欧美高清成人免费视频www| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 久久久久精品久久久久真实原创| 在线免费十八禁| 日本-黄色视频高清免费观看| 18禁在线播放成人免费| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 简卡轻食公司| 91久久精品电影网| 久99久视频精品免费| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲电影在线观看av| 毛片女人毛片| 插逼视频在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 免费观看在线日韩| 性色avwww在线观看| 高清午夜精品一区二区三区| 午夜免费激情av| 搞女人的毛片| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲人成网站在线播| 成人国产麻豆网| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 免费av毛片视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产高清三级在线| 午夜激情久久久久久久| 亚洲最大成人中文| 亚洲不卡免费看| 亚洲精品成人久久久久久| 别揉我奶头 嗯啊视频| 日韩制服骚丝袜av| 丝袜喷水一区| 精品久久久久久久久av| 国产午夜精品一二区理论片| 精品一区在线观看国产| kizo精华| 一夜夜www| 色综合色国产| 亚洲高清免费不卡视频| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲va在线va天堂va国产| 精品熟女少妇av免费看| 毛片女人毛片| 日韩av不卡免费在线播放| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲乱码一区二区免费版| 少妇熟女欧美另类| 欧美日韩在线观看h| 亚洲人成网站在线播| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产色爽女视频免费观看| 国产精品人妻久久久影院| 免费人成在线观看视频色| 搡老乐熟女国产| 久久精品国产亚洲av涩爱| av在线播放精品| 亚洲色图av天堂| 国产精品熟女久久久久浪| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产精品一区www在线观看| 亚洲av国产av综合av卡| 免费看av在线观看网站| 国产不卡一卡二| 精品人妻一区二区三区麻豆| 色吧在线观看| 免费少妇av软件| 激情 狠狠 欧美| 一个人看视频在线观看www免费| 欧美成人a在线观看| 亚洲电影在线观看av| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产真实伦视频高清在线观看|