Tn5轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)表達(dá)豬瘟E2蛋白和EGFP重組偽狂犬病毒的構(gòu)建

高 博， 范志強(qiáng)，韓乃君，張 念，張錦霞，王 穎，白安斌，黃紅梅，扈榮良， 吳健敏

(1. 廣西大學(xué), 南寧530005；2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所, 長春 130122；3. 廣西獸醫(yī)研究所, 南寧 530001)

豬瘟是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的一類高度接觸性傳染病，因其危害巨大，國際獸醫(yī)局（OIE）將其列為須報告的16種動物傳染病之一[1,2]。CSFV屬黃病毒科、瘟病毒屬，基因組為單股正鏈RNA病毒，全長為12.3 kb，編碼3989個氨基酸[3]。研究表明，編碼370個氨基酸的E2囊膜糖蛋白是其主要的保護(hù)性抗原蛋白，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)[4]。因此，新型豬瘟疫苗的研制主要是圍繞E2蛋白展開的。

偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）是皰疹病毒的一員，可引起多種家畜和野生動物發(fā)熱、奇癢和腦脊髓炎[5]。PRV病毒基因組為線性雙鏈DNA分子，約150 kb。因PRV具有基因背景清楚，遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)；含有許多病毒復(fù)制的非必需基因，外源基因容量大（30 kb）；宿主范圍廣泛，且不感染人，安全性好等優(yōu)點，因此本研究將其作為首選的病毒載體。

轉(zhuǎn)座子（Transponson，Tn），又稱易位子，是指存在于染色體DNA上可以自主復(fù)制和位移的一段DNA順序。1951年，Barbara Mclintock 首先在玉米中發(fā)現(xiàn)了控制元件，后來被命名為轉(zhuǎn)座元件或轉(zhuǎn)座子[6]。轉(zhuǎn)座子可以在不同復(fù)制子之間轉(zhuǎn)移，以非正常重組方式從一個位點插入到另一個位點，對新位點基因的結(jié)構(gòu)與表達(dá)產(chǎn)生多種遺傳效應(yīng)。本研究所用的Tn5轉(zhuǎn)座子是一種細(xì)菌的轉(zhuǎn)座子，兩端分別帶有轉(zhuǎn)座元件IS50R和IS50L ，可在Tn5轉(zhuǎn)座酶催化下隨機(jī)插入、整合到目標(biāo)DNA序列中，同時帶入兩端轉(zhuǎn)座元件以內(nèi)的DNA 序列，從而使外源基因可以隨機(jī)地插入靶基因[7]。

本研究利用Tn5轉(zhuǎn)座子可以攜帶外源基因的功能，將豬瘟E2基因和報告基因EGFP（增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因，enhanced green fluoresce protein）隨機(jī)地插入偽狂犬病毒的基因組中，構(gòu)建了可以表達(dá)豬瘟E2蛋白和熒光蛋白的重組病毒。

1 材料和方法

1.1 病毒、質(zhì)粒、細(xì)胞、菌種 豬瘟疫苗購自杭州薦量獸用生物制品有限公司；pEGFP-N1、pIRESneo質(zhì) 粒、BHK-21細(xì) 胞、PRV Bartha-K61株、DH5α菌種均為本實驗室保存；pMD18-T購自TaKaRa公司；EZ-Tn5 pMOD-2購自EPICENTRE公司。

1. 2 試劑 AMV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor、dNTP、Ex-Taq DNA 聚 合 酶、CAIP、T4 DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶ApaI、BamH I、Bst1107 I、EcoR V、Hind III、NruI、SmaI、XhoI、PvuII均購自TaKaRa公司；Klenow購自Biolabs公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自Axygen公司。

1.3 設(shè)計與合成 參考GenBank關(guān)于C株的全基因序列，利用primer5.0設(shè)計并合成兩對針對豬瘟病毒E2基因全長的特異性引物和一對E2基因的鑒定引物（劃線部分為引入的酶切位點EcoR V和BamH I），由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences for PCR

1.4 載體的構(gòu)建 以豬瘟疫苗為模板，提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR后，采用巢式PCR擴(kuò)增出E2全基因序列，連接至pMD18-T載體并測序。將測序正確的E2基因經(jīng)EcoR V和BamH I酶切之后定向克隆至pIRESneor真核質(zhì)粒的多克隆位上，得到真核表達(dá)質(zhì)粒pIRESneor-E2。ApaI和PvuII雙酶切pEGFP-N1；SmaI和XhoI雙酶切 pIRESneor-E2，klenow和dNTP補(bǔ)平之后，用EGFP表達(dá)盒替換pIRESneor-E2的neor基因，構(gòu)建包含有E2基因和EGFP串聯(lián)表達(dá)盒的質(zhì)粒pIRES-E2-GFP。Mlu I和Bst1107I酶切pIRES-E2-GFP，將含有從CMV啟動子到Poly(A)尾之間的表達(dá)盒定向克隆至經(jīng)Sma I酶切的TNTMpMOD-2的多克隆位點處，構(gòu)建轉(zhuǎn)座質(zhì)粒TNTMpMOD-E2-GFP。

1.5 轉(zhuǎn)座片段的回收 Pvu II單酶切轉(zhuǎn)座質(zhì)粒TNTMpMOD-E2-GFP，凝膠試劑盒純化含有轉(zhuǎn)座序列和目的基因的線性化轉(zhuǎn)座片段Line-TNTMpMOD-E2-GFP。

1.6 PRV基因組的提取 將PRV接種于長滿單層的BHK-21細(xì)胞，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待其80%的細(xì)胞病變并脫落時，回收脫落的細(xì)胞，未脫落的細(xì)胞使用細(xì)胞刮子刮下。4 ℃、4500×g離心10 min，棄去上清，沉淀下來的細(xì)胞使用PBS（pH 7.4）重新懸浮。其余的提取 PRV 基因組DNA 的實驗步驟按參考文獻(xiàn)[8]介紹的方法進(jìn)行

1.7 體外轉(zhuǎn)座 將線性化的TNTMpMODTM-E2-GFP與偽狂犬病毒基因組在Tn5轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)座。體系如下：1μL EZ-Tn5 10X Reaction Buffer、2μL（0.2μg）PRV genome、6μL Line-TNTMpMODTM-E2-GFP、1μL EZ-Tn5 Transposase，37 ℃水浴120 min，隨后加入終止液，70 ℃水浴10 min，終止反應(yīng)。

1.8 轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前，用不含青鏈霉素和胎牛血清的MEM培養(yǎng)基洗滌六孔板中長滿單層的BHK細(xì)胞2次，加入1.5 mL的雙無培養(yǎng)基培養(yǎng)。取轉(zhuǎn)座產(chǎn)物4μL，無菌加入200μL雙無MEM，渦旋混勻，室溫靜止放置5 min。加入FuGENERHD Transfection Reagent的轉(zhuǎn)染試劑6μL，渦旋混勻后室溫放置15 min。將混合物逐滴加入六孔板中，并輕微晃動，使其混合均勻。

1.9 重組病毒的拯救 轉(zhuǎn)染后6 h換正常MEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h。將其反復(fù)凍融2次，接BHK-21細(xì)胞。8～12 h后，熒光顯微鏡下觀察，若有熒光出現(xiàn)，則認(rèn)為重組病毒已成功被拯救。

1.10 重組病毒的PCR鑒定 取重組病毒的細(xì)胞凍融物少許，煮沸5 min，離心取上清，進(jìn)行PCR鑒定。1.11 病毒的純化 將轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)熒光的細(xì)胞反復(fù)凍融2次，100陪稀釋后接種BHK-21細(xì)胞，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h。反復(fù)凍融2次，再次100倍稀釋后接種BHK-21細(xì)胞，如此反復(fù)稀釋3次后，利用顯微操作技術(shù)，熒光顯微鏡下用顯微注射針（末端為平頭，直徑為25～30μm）挑取出現(xiàn)熒光的單個細(xì)胞，接種BHK-21，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h。待出現(xiàn)大面積的熒光灶之后，再次挑選單個熒光細(xì)胞，接種BHK-21細(xì)胞。如此反復(fù)3次之后，可以初步認(rèn)為病毒純化完全。

1.12 間接免疫熒光試驗 將BHK細(xì)胞鋪于六孔板中，待其長滿單層，接種純化后的重組病毒，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h；然后丙酮固定10 min，加入抗CSFV E2的抗體，37 ℃作用2 h，PBS洗滌3次；加入熒光標(biāo)記的羊抗豬IgG，37 ℃作用30 min，PBS洗滌3次，吹干，加入緩沖甘油，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 E2基因的PCR鑒定結(jié)果 以豬瘟疫苗為模板，RT-PCR擴(kuò)增豬瘟病毒E2基因全長，獲得大小為1110 bp的片段，結(jié)果如圖1。

圖1 豬瘟病毒E2基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplificetion of E2 gene of CSFV

2.2 重組穿梭載體的酶切鑒定 以Pvu II酶切TNTMpMODTM-E2-GFP重組質(zhì)粒，獲得大小2367 bp和5355 bp兩個片段，結(jié)果如圖2。

2.3 重組病毒的包裝 將初次轉(zhuǎn)染的BHK-21反復(fù)凍融2次，100倍稀釋接種BHK-21細(xì)胞，為F1代；將F1代反復(fù)凍融2次，100倍稀釋接種BHK-21細(xì)胞，為F2代，如圖3。

2.4 重組病毒的純化 利用顯微操作技術(shù)，挑取單個熒光細(xì)胞接種BHK細(xì)胞。連續(xù)純化3代，分別命名為一代重組病毒、二代重病毒、三代重組病毒，如圖4。

2.5 重組病毒的PCR鑒定 取病變的細(xì)胞上清，煮沸5 min，10 303×g離心5 min，作為模板，用設(shè)計的鑒定引物進(jìn)行PCR鑒定，獲得324 bp的片段，如圖5。

2.6 間接免疫熒光（Indirect immuno fl uorescence）取第3代純化的病毒100倍稀釋接種BHK細(xì)胞，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)12 h，丙酮和甲醛1:1固定之后，以CSFV鼠源高免血清為一抗，以熒光標(biāo)記的羊抗鼠的IgG為二抗，進(jìn)行間接免疫熒光試驗，結(jié)果如圖6。

3 討論

豬瘟每年對全世界范圍內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)都造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，疫苗接種是目前防控豬瘟的主要手段。長期以來，中國兔化弱毒疫苗在豬瘟的預(yù)防中起到了巨大作用，然而近年來隱形感染、周期性、波浪型及非典型豬瘟等新疫情的出現(xiàn)，對弱毒疫苗的使用提出了新的挑戰(zhàn)。同時，目前血清學(xué)方法檢測很難區(qū)別疫苗免疫與野毒感染，為豬以及其相關(guān)產(chǎn)品的貿(mào)易帶來了不便，因此新型標(biāo)記疫苗的研制成為當(dāng)前研究的熱點[9]?；蚬こ虂唵挝灰呙?、病毒活載體疫苗、DNA疫苗等新型疫苗的研制為豬瘟的預(yù)防提供了新的工具和手段。其中活載體疫苗因其免疫動物時向宿主免疫系統(tǒng)提交免疫原性蛋白的方式與自然感染時的真實情況很接近，可誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫比較廣泛，包括體液免疫和細(xì)胞免疫，甚至黏膜免疫等優(yōu)點，為眾多研究者所青睞。豬瘟病毒E2蛋白是誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體的主要抗原結(jié)構(gòu)蛋白，針對E2 囊膜糖蛋白的研究成為攻克豬瘟的熱點。本研究構(gòu)建了針對豬瘟病毒E2蛋白的重組活載體疫苗，并通過間接免疫熒光定性的鑒定E2的表達(dá)，為疫苗的研制進(jìn)一步打下了基礎(chǔ)。

本研究將CSFV E2基因作為外源基因通過轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)，隨機(jī)插入靶基因PRV病毒基因組中并獲得了表達(dá)，此方法為活載體疫苗的構(gòu)建提供了新的思路。但轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)外源基因在靶基因的隨機(jī)插入之后，對靶基因產(chǎn)生的遺傳學(xué)效應(yīng)還需進(jìn)一步探討。利用Northern印跡雜交和全基因測序等方法可以對插入的外源基因進(jìn)行準(zhǔn)確的定位，弄清外源基因的插入是否對靶基因主要抗原區(qū)產(chǎn)生至關(guān)重要的影響，從而對重組疫苗進(jìn)行整體的評價。

目前，重組病毒的篩選一般通過多次有限稀釋或病毒蝕斑克隆，需要大量的人力和物力，并存在重組病毒在篩選過程大量丟失等情況。本研究將顯微操作和病毒的純化有機(jī)的結(jié)合起來，大大縮短了實驗室階段重組病毒的篩選所耗費的時間，為重組病毒篩選提供了新思路。

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