以 FOXP3為靶點的免疫抑制劑藥物篩選模型的建立

巫曄翔，司書毅，蔣建東，唐巍然

在 20 世紀 70年代曾有學者發(fā)現(xiàn)一群 T 細胞具有免疫抑制功能，但直至 1995年Sakaguchi等[1]發(fā)現(xiàn) CD4+CD25+ 為調(diào)節(jié)性 T 細胞的表面標志后，人們才開始對調(diào)節(jié)性 T 細胞的分化、發(fā)育和功能進行深入的研究，并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子FOXP3在調(diào)節(jié)性 T 細胞中的作用，開始關(guān)注調(diào)節(jié)性 T 細胞在維持機體免疫耐受，防止自身免疫性疾病的發(fā)生，抗移植物排斥以及腫瘤免疫中的重要作用。

FOXP3是一種具有叉頭螺旋（forkhead/winged helix）結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[2]。它的基因編碼產(chǎn)物是一個分子量為48 kD 的 Scurfin 蛋白質(zhì)。它主要表達于 CD4+/CD25+ 調(diào)節(jié)性 T 細胞，是決定調(diào)節(jié)性 T 細胞免疫抑制功能的關(guān)鍵基因。盡管有關(guān)FOXP3的信號傳導途徑還有待進一步研究，但Hori 等的研究表明FOXP3能夠特異性地表達于CD4+ 的調(diào)節(jié)性 T 細胞，CD4+/CD25- 細胞在轉(zhuǎn)染FOXP3基因后能夠賦予這些細胞具有調(diào)節(jié)性T 細胞的表型，具有高表達水平的 CD25、CD103、GITR、CTLA4 和低水平表達的細胞因子[3-5]，是控制調(diào)節(jié)性 T 細胞發(fā)生分化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)染FOXP3基因的 CD4+/CD25– 細胞在體外通過細胞間接觸可發(fā)揮其免疫抑制功能，在體內(nèi)能夠抑制自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發(fā)生。FOXP3還能夠抑制自身反應(yīng)性 T 細胞功能，F(xiàn)OXP3功能缺陷會導致許多自身免疫病的出現(xiàn)如：糖尿病、濕疹、變態(tài)反應(yīng)性疾病、淋巴細胞增生等。而FOXP3功能的異常增強也會導致病理性的免疫抑制和腫瘤疾病的發(fā)生[6-7]。

這些研究結(jié)果表明調(diào)節(jié)性 T 細胞中的轉(zhuǎn)錄因子FOXP3不僅有望成為治療自身免疫病，變態(tài)反應(yīng)性疾病和解決移植排斥反應(yīng)難題的作用靶點，而且也可能成為腫瘤免疫學治療中的理想治療靶點之一。盡管已有瞬時表達FOXP3細胞用于研究其功能的報道，但有關(guān)建立以FOXP3為靶點永久、穩(wěn)定細胞系用于高通量篩選免疫抑制劑的細胞模型，尚未見文獻報道。為此，我們將轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子FOXP3基因啟動子克隆到 pGeneBLAzer-TOPO載體中并與報告子 β-內(nèi)酰胺酶相偶聯(lián)，建立以FOXP3為靶點的免疫抑制劑藥物篩選模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒，菌株和細胞株：真核細胞表達載體pGeneBLAzer-TOPO 為美國 Invitrogen 公司產(chǎn)品；大腸桿菌E.coliDH5α 為大連寶生物工程公司產(chǎn)品；Jurkat 細胞株為中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所提供。

1.1.2 主要試劑 轉(zhuǎn)染試劑（Lipofectamine 2000）購自美國 Invitrogen 公司；基因組提取試劑盒、DNA 回收試劑盒、DNA 聚合酶（PrimeSTARTMHS DNA polymerase）購自大連寶生物工程公司；G418購自美國 Amresco 公司；PMA（Phorbol 12-myristate 13-acetate）和 Ionophore 購自美國 Sigama 公司；前列腺素 E2（PGE2）購自美國 Cayman Chemical公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的體外擴增 用廣譜基因組DNA 抽提試劑盒從正常人外周血單核細胞中分離基因組 DNA，并以此為模板，通過自行設(shè)計引物，使用 PrimeSTARTMHspolymerase 進行 PCR 擴增FOXP3啟動子全區(qū)域 1834 bp。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 將 PCR 擴增的DNA 片段切膠回收純化，T-A 克隆至pGeneBLAzer-TOPO 載體上，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中增殖擴增，提取純化質(zhì)粒，通過 PCR 選擇插入正方向片段的質(zhì)?？寺?，測序鑒定插入片段的DNA 全序列，選取與 GeneBank AF235097 序列有100%同源性的克隆作為轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒。

1.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞和建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株 將 Jurkat 細胞培養(yǎng)于 6 孔無菌培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)基為不含抗生素的 RPMI 1640 培養(yǎng)液。采用脂質(zhì)體法用 LipofectamineTM2000 Reagent 試劑盒轉(zhuǎn)染FOXP3啟動子/pGeneBLAzer-TOPO 載體于培養(yǎng)的 Jurkat 細胞后，置于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng) 18～48 h。其間每 6～8 h 換液一次，用新鮮的含 10%FBS 的 1640 無雙抗培養(yǎng)液換掉轉(zhuǎn)染液，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。以含 G418 1100 μg/ml 的選擇性培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。

1.2.4 轉(zhuǎn)染細胞株中外源性基因穩(wěn)定性的鑒定 將經(jīng) G418 選擇性培養(yǎng)基篩選的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，經(jīng)多次傳代后，以未轉(zhuǎn)染的 Jurkat 細胞為對照，用基因組提取試劑盒提取 Jurkat 細胞基因組，以 PCR 擴增融合載體中FOXP3啟動子DNA 片段。

FOXP3擴增引物：上游引物：T7 promoter primer（源自 pGeneBLAzer-TOPO 載體）：5’ TAAT ACGACTCACTATAGGGA 3’；下游引物：primer 2（源自FOXP3啟動子序列）：5’ ACCTTACCTGG CTGGAATCACG 3’，片段長度：1934 bp。

管家基因GAPDH：上游引物：5’ CAACGGAT TTGGTCGTATTG 3’；下游引物：5’ CTTCCACGAT ACCAAAGTTGTC 3’，片段長度：493 bp。

1.2.5 轉(zhuǎn)染細胞株中FOXP3基因啟動子活性的檢測 以 PMA 20 ng/ml、Ionophore 1 μg/ml 和PGE226 μm 單獨和聯(lián)合刺激穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株 18 h后[8]，將 GeneBLAzer Detection kits 提供的熒光底物（CCF2-AM）加入細胞中后移至 96 孔培養(yǎng)板中室溫孵育 1 h。通過熒光檢測儀讀取 460 nm 藍色熒光數(shù)值（a）和 530 nm 的綠色熒光數(shù)值（b）。β-內(nèi)酰胺酶活性評價采用比率制讀數(shù)：Ratio = a/b，當 β-內(nèi)酰胺酶上游的FOXP3啟動子對刺激物反應(yīng)，驅(qū)使下游 β-內(nèi)酰胺酶表達時在加入底物的細胞群中呈現(xiàn)藍色熒光，反之細胞群中則呈現(xiàn)綠色熒光。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的體外擴增

以人類基因組 DNA 為模版，PCR 擴增FOXP3啟動子全長，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，獲得 1.8 kb 的 DNA 片段，如圖1 所示。

圖1 PCR 擴增產(chǎn)物人類 FOXP3 基因啟動子的瓊脂糖凝膠電泳檢測Figure 1 Human FOXP3 promoter fragment amplified with PCR was analyzed by gel electrophoresis

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和測序鑒定

圖2 FOXP3 啟動子/pGeneBLAzer-TOPO 重組載體模式圖Figure 2 The schema for construct FOXP3 promoter/pGeneBLAzer-TOPO

圖3 人類 FOXP3 啟動子序列（GenBank accession NO.AF235097）Figure 3 Sequence of human FOXP3 promoter region(GenBank accession NO.AF235097)

如圖3 所示，將此 PCR 擴增產(chǎn)物克隆至pGeneBLAzer-TOPO 載體中，挑取含有插入正向片段質(zhì)粒的菌落，提取菌落精制質(zhì)粒。使用 T7 promoter primer 和自行設(shè)計的引物對上述質(zhì)粒進行 DNA 測序（圖3）。其中 CTB573-23DNA 序列與文獻[9]報道以及 GeneBank 中所登錄的序列具有高度同源性。其余克隆都不同程度上存在有若干突變點。故選擇該克隆融合載體作為轉(zhuǎn)染細胞用質(zhì)粒。

2.3 轉(zhuǎn)染細胞株中外源性基因穩(wěn)定性的鑒定

以未轉(zhuǎn)染的 Jurkat 細胞為對照，用基因組提取試劑盒提取轉(zhuǎn)染 Jurkat 細胞及對照組細胞基因組，以其為模板，PCR 擴增確定 Jurkat 細胞基因組中是否整合有已構(gòu)建的FOXP3啟動子/pGeneBLAzer- TOPO 載體。結(jié)果表明：以對照Jurkat 細胞基因組為模板，以 pGeneBLAzer-TOPO載體序列為上游引物，以FOXP3啟動子序列為下游引物的 PCR 產(chǎn)物中沒有擴增出任何 DNA 片段（圖4，Lane 2），而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有融合載體的兩個Jurkat 細胞株卻能夠擴增出長度為1.9 kb 的DNA 片段，如圖4 中 3～4 泳道所示。在以轉(zhuǎn)染細胞與對照細胞基因組為模板的管家基因GAPDH 的 PCR 中均能擴增出長度為493 bp 的GAPDH DNA 片段（圖4，Lane 5～7）。上述結(jié)果表明：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 Jurkat 細胞基因組中已整合有已構(gòu)建的啟動子融合載體，并能夠穩(wěn)定地隨 Jurkat細胞傳代培養(yǎng)。

圖4 PCR 擴增轉(zhuǎn)染細胞基因組片段的瓊脂糖電泳檢測Figure 4 The fragments of transfectant genome amplified with PCR were analyzed by gel electrophoresis

2.4 陽性對照 PGE2 對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中目的基因啟動子活性的影響

以 PGE226 μm 以及 PMA 20 ng/ml 和Ionophore 1 μg/ml（PI）單獨和聯(lián)合刺激穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株 18 h 后，將 GeneBlazer Detection kits 提供的熒光底物（CCF2-AM）加入細胞中后移至 96 孔培養(yǎng)板中室溫孵育 1 h。通過熒光檢測儀讀取 460 nm藍色熒光數(shù)值和 530 nm 的綠色熒光數(shù)值。結(jié)果如圖5 所示：PGE2以及 PI 均能夠提高FOXP3啟動子活性。該實驗結(jié)果表明：啟動子刺激物能夠有效地作用于已構(gòu)建的FOXP3啟動子/pGeneBLAzer-TOPO 載體，啟動子活性能夠通過其下游的報告子β-內(nèi)酰胺酶活性得以準確的反映。利用該模型我們篩選了研究所內(nèi) 2500 余種天然產(chǎn)物，獲得 4 種對FOXP3啟動子具有上調(diào)作用的天然產(chǎn)物（圖6），這些結(jié)果表明：該模型具有用于以FOXP3基因為靶點的藥物篩選可行性。

圖5 以 β-內(nèi)酰胺酶報告子檢測 Jurkat 細胞 FOXP3 啟動子活性。分別用 PGE2（26 μm）；PI（PMA 20 ng/ml 和Ionophore 1 μg/ml）和 PI/PGE2 刺激 Jurkat 細胞株Figure 5 FOXP3 promoter activity was analyzed by fluorescent detection of β-lactamase reporter activity in Jurkat cell lines.Jurkat was stimulated with PGE2 (26 μm); PI(PMA 20 ng/ml and Ionophore 1 μg/ml) and PI/PGE2

圖6 用篩選模型高通量篩選 2500 余種天然產(chǎn)物Figure 6 2500 natural products were screened using the screening model

3 討論

在本項研究中，我們克隆了FOXP3基因啟動子片段，構(gòu)建了FOXP3基因啟動子/pGeneBLAzer-TOPO 載體，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染該融合載體的 Jurkat細胞株。探討了陽性對照 PGE2對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中目的基因啟動子活性的影響，同時篩選了我們研究所中的 2500 余種天然產(chǎn)物。

我們從人類外周血單核細胞中提取人類基因組，并以其為模板 PCR 擴增FOXP3基因啟動子片段，測序結(jié)果表明該區(qū)域序列與 GenBank AF235097 具有100%的同源性，真核細胞核心啟動子的標志性元件 TATA、GC、CAAT box 均存在于啟動子區(qū)域中，并含有 NFAT、AP-1 等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和 TSS 轉(zhuǎn)錄起始位點[9]。

我們將轉(zhuǎn)錄因子FOXP3基因啟動子克隆到pGeneBLAzer-TOPO 載體，并與報告子基因 β-內(nèi)酰胺酶相偶聯(lián)，經(jīng) G418 抗性篩選和外源性基因穩(wěn)定性的鑒定結(jié)果表明：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 Jurkat 細胞株的基因組中整合有FOXP3啟動子/pGeneBLAzer-TOPO 載體，并能夠穩(wěn)定地隨 Jurkat 細胞傳代培養(yǎng)。這表明我們已得到有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染靶基因啟動子的細胞株。在檢測刺激物對FOXP3啟動子活性影響的實驗中，我們選擇文獻[8]報道的 PGE2用于檢測陽性刺激物對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中FOXP3啟動子活性的影響，實驗結(jié)果表明：陽性刺激物能夠提高穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中FOXP3啟動子活性，而 PGE2對經(jīng) PI 激活的 Jurkat 細胞對啟動子活性的影響要優(yōu)于單獨使用 PGE2。PGE2、PMA 和 Ionophore 對FOXP3啟動子活性的影響以及高通量篩選 2500余種天然產(chǎn)物的實驗結(jié)果表明：我們建立的藥物篩選模型能夠適用于檢測該啟動子活性，具有進行高通量藥物篩選的可行性。有關(guān)已得到的陽性天然產(chǎn)物對FOXP3基因表達的影響目前正在研究中。

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