雷公藤紅素逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞多藥耐藥的實驗研究

胡 婕 張 茵 馬保根 翟亞萍 李玉龍 程 薇

白血病是造血系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，目前常用的治療方法是化療，雖然化療能使多數(shù)患者達(dá)到緩解，但仍有大部分患者因為化療失敗而死亡。導(dǎo)致化療失敗的原因有很多，其中最主要的是白血病細(xì)胞的多藥耐藥(MDR)性的產(chǎn)生。這也是國內(nèi)目前研究的熱點(diǎn)。

雷公藤紅素(celastrol)是1種三萜類天然化合物，又名南蛇藤素，具有免疫抑制、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞體外增值、抑制HMC-1細(xì)胞的黏附及其黏附分子表達(dá)，雷公藤紅素還能體外誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1299、人急性髓系白血病細(xì)胞株HL-60、惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤株、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等腫瘤的凋亡。最近有報道雷公藤紅素為1種蛋白酶體抑制劑[1]。本實驗對雷公藤紅素逆轉(zhuǎn)K652/A02細(xì)胞多藥耐藥進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株來源

人慢性粒細(xì)胞白血病紅白血病急粒變耐阿霉素K562/A02細(xì)胞株由山東大學(xué)齊魯醫(yī)院紀(jì)春巖教授惠贈。人慢性粒細(xì)胞白血病紅白血病急粒變K562細(xì)胞株由鄭州大學(xué)干細(xì)胞中心常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2 主要儀器和試劑

雷公藤紅素(Celastrol，Solarbio 純度>98%)以DMSO(Sigma公司)助溶為1 mmol/L濃度保存于-20℃冰箱備用；CCK-8試劑盒為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；P-gp抗體為上海晶天生物科技有限公司產(chǎn)品；阿霉素(ADM)為浙江海正藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；維拉帕米為上海禾豐制藥有限公司產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)基為GIBCOBRL公司產(chǎn)品；新生牛血清為杭州四季青產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀(FACSCalibur )為美國BD公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀(Bio-RAD680)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實驗分組 K562細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，K562/A02細(xì)胞培養(yǎng)于含阿霉素(1 μmol/L)的上述培養(yǎng)基中，將2種細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，2～3天傳代1次，其中K562/A02細(xì)胞在實驗前兩周改用無阿霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。實驗分組如下：①K562細(xì)胞+ADM； ② K562細(xì)胞+雷公藤紅素；③K562/A02細(xì)胞+ADM；④ K562/A02細(xì)胞+雷公藤紅素；⑤ K562/A02細(xì)胞+ADM+雷公藤紅素。

1.3.2 CCK-8法檢測ADM、雷公藤紅素的細(xì)胞毒性及耐藥細(xì)胞的耐藥倍數(shù) 取對數(shù)生長期的K562和K562/A02細(xì)胞(2～3×104cell/孔)于96孔板中，由高到低濃度分別加入ADM(160、80、40、20、10、5、2.5、1.25 μmol/L),雷公藤紅素(320、160、80、40、20、10、5、2.5 μmol/L)，每孔設(shè)3個平行孔，終體積為150 μl。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，每孔加入CCK-8試劑10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，以空白孔調(diào)零，全自動酶標(biāo)儀于450 nm處測吸光度值，參比波長為650 nm，采用SPSS16.0軟件計算生長抑制率50%時的藥物濃度即半數(shù)抑制率(IC50)[2，3]。抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%；耐藥倍數(shù)=(耐藥細(xì)胞的IC50/敏感細(xì)胞的IC50)。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3 CCK-8法檢測雷公藤紅素耐藥逆轉(zhuǎn)性 取對數(shù)生長期的K562/A02細(xì)胞(2～3×104個細(xì)胞/孔)于96孔板中。實驗分組：①K562/A02，②K562/A02+雷公藤紅素，③K562/A02+VLP。所加ADM等藥物濃度同上，每孔設(shè)3個平行孔，終體積為150 μl。并用維拉帕米(VLP)組5 μg/L作為陽性對照[4]。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育72 h后加入10 μl CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，以空白孔調(diào)零，檢測波長同上。計算半數(shù)抑制率(IC50)。實驗重復(fù)3次。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=(耐藥細(xì)胞逆轉(zhuǎn)前的IC50/耐藥細(xì)胞逆轉(zhuǎn)后的IC50)。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測K562和K562/A02細(xì)胞內(nèi)的ADM濃度 取對數(shù)生長期細(xì)胞于24孔板中，實驗分6組:① K562/A02，② K562/A02+ADM，③ K562/A02+ADM+雷公藤紅素(IC10)，④ K562/A02+ADM+雷公藤紅素(IC50)，⑤ K562，⑥K562+ADM。第③、④組分別先加入IC10和IC50的雷公藤紅素，24 h后在第②③④⑥組中再加入ADM10 μg/ml，藥物作用3 h，收集細(xì)胞1×106個細(xì)胞，冷PBS(4℃,0.01 mol/L，PH7.4)洗滌2次，再重懸于冷PBS液中，4℃保存至上樣進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(激發(fā)波長Ex=488 nm，發(fā)射波長Em=575 nm)[5]。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測P-gp表達(dá) 取對數(shù)生長期細(xì)胞于24孔板中，實驗分4組分別為：①K562/A02，②K562/A02+ADM(IC50)，③K562/A02+雷公藤紅素(IC50)，④K562/A02+ADM(IC50)+雷公藤紅素(IC50)；置培養(yǎng)箱孵育48 h后，收集細(xì)胞，約3×105個細(xì)胞，用冷的PBS液洗2遍，按操作說明加入P-gp抗體，室溫下避光孵育30 min后上流式細(xì)胞儀檢測，并給出相應(yīng)的P-gp表達(dá)率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 雷公藤紅素對K562、K562/A02細(xì)胞的增殖抑制作用

雷公藤紅素對K562及K562/A02抑制率見表1。雷公藤紅素對K562和K562/AO2細(xì)胞的IC50分別為(411.59±26.551)μmol/L和 (295.58±23.288)μmol/L,兩者差異明顯(P<0.05)，說明K562/A02細(xì)胞對雷公藤紅素不具有耐藥性。ADM對K562、K562/A02的IC50分別為(0.749±0.741)μmol/L、(59.755±6.883)μmol/L，耐藥倍數(shù)為79.78倍，說明K562/A02對ADM有明顯的耐藥性(P<0.05)。細(xì)胞毒劑量的雷公藤紅素可降低ADM對K562/A02細(xì)胞的IC50，提高對ADM的敏感性，應(yīng)用雷公藤紅素后，IC50為(0.507±0.070)μmol/L，與單用ADM組比較明顯下降(P<0.05)，耐藥性逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(RF)為117.860倍；而加入5 μg/L維拉帕米后的IC50為(17.196±6.303)μmol/L，也明顯低于單用ADM組(P<0.05),RF為3.745，見表2。

2.2 雷公藤紅素對K562/A02細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度的影響

應(yīng)用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測K562/A02細(xì)胞內(nèi)的ADM濃度。由表3可見加入雷公藤紅素后，細(xì)胞內(nèi)的ADM濃度明顯增加，加入IC10濃度的雷公藤紅素和IC50濃度的雷公藤紅素后，細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度差異顯著(P<0.05)。

表1 雷公藤紅素和阿霉素對K562、K562/A02細(xì)胞的增殖抑制作用

表2 雷公藤紅素對K562/A02細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)

注：與K562/A02+ADM組比較，△、☆為P<0.05

表3 雷公藤紅素對K562/A02細(xì)胞內(nèi)ADM熒光強(qiáng)度的影響

注：與第②組比較，※、#為P<0.05；與第③組比較，★為P<0.05

2.3 流式細(xì)胞儀(FCM)檢測P-gp表達(dá)

從圖1中可見，單用阿霉素對P-gp表達(dá)無明顯影響；但應(yīng)用雷公藤紅素能明顯減弱P-gp的表達(dá)，且加用ADM后，P-gp表達(dá)也明顯下降。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測P-gp表達(dá)結(jié)果圖中波峰高度為P-gp的表達(dá)強(qiáng)度

3 討論

多藥耐藥(multidrungresistance,MDR)是指腫瘤細(xì)胞對1種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的同時，對結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的其他多種抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥性。腫瘤對化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥性(MDR)是導(dǎo)致治療失敗的主要原因之一。目前研究表明MDR的產(chǎn)生有多種機(jī)制，主要有[6]：①腫瘤細(xì)胞表面ATP結(jié)合膜蛋白的表達(dá)增加或活性提高，包括P糖蛋白( P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)、肺抗藥性相關(guān)蛋白(LRP)、乳腺癌抗藥性相關(guān)蛋白(BRCP)等幾類；②谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S transferase)的表達(dá)增加或活性增強(qiáng)；③TOPOⅡ含量減少及活性降低；④蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的表達(dá)增加或活性增強(qiáng)；⑤腫瘤細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)。其中P-gp介導(dǎo)的MDR是研究最多最為廣泛的機(jī)制之一，被稱為多藥耐藥的經(jīng)典途徑[7]。

P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是由位于人7q21.1的多藥耐藥基因1(MDR1)編碼，Juliano在1976年發(fā)現(xiàn)P-gp后，已經(jīng)證實P-gp高表達(dá)為MDR的主要機(jī)制。P-gp可以通過它的疏水位點(diǎn)與疏水性抗腫瘤藥物結(jié)合，通過ATP水解供能，逆濃度梯度將藥物泵出細(xì)胞外；還可以使從而使藥物濃度低于殺傷濃度；還可以使藥物在細(xì)胞內(nèi)再分布，導(dǎo)致藥物聚集于與藥物作用無關(guān)的細(xì)胞器如溶酶體內(nèi)，從而使腫瘤細(xì)胞發(fā)生MDR[8]。P-gp蛋白的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞膜上蛋白的表達(dá)量成正比。

雷公藤紅素對多種腫瘤細(xì)胞有殺滅作用和對腫瘤血管的生成有直接抑制作用，其抑瘤率達(dá)65%～93%，已超過紫杉醇[9]。但是其阻滯細(xì)胞周期[10]、激活經(jīng)典凋亡途徑的毒性也限制了它的使用[11]。本研究顯示雷公藤紅素對K562/A02細(xì)胞有抑制作用，為進(jìn)一步觀察雷公藤紅素逆轉(zhuǎn)的機(jī)制，運(yùn)用流式細(xì)胞儀對MDR1所表達(dá)的P-gp及其功能進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示細(xì)胞毒劑量的雷公藤紅素能明顯降低P-gp的表達(dá)，而且用雷公藤紅素后，細(xì)胞內(nèi)的ADM濃度明顯增加，并與所加雷公藤紅素的劑量呈正相關(guān)，提示雷公藤紅素由于下調(diào)了P-gp的表達(dá)，使其將化療藥泵出細(xì)胞的功能受抑，使化療藥在白血病細(xì)胞內(nèi)能達(dá)到有效地濃度，從而可以殺死白血病細(xì)胞，達(dá)到逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞耐藥的目的。但是經(jīng)典的抗腫瘤藥物或低毒的中藥制劑在臨床應(yīng)用中仍受到劑量的限制。本研究實驗結(jié)果表明雷公藤紅素在體外可以達(dá)到很好的逆轉(zhuǎn)效果，為臨床應(yīng)用提供了一個實驗依據(jù)，但體內(nèi)能否達(dá)到類似的逆轉(zhuǎn)效果有待進(jìn)一步的工作。

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