黃芪多糖對(duì)斑馬魚生長發(fā)育及衰老的影響

夏廣清，韓曉娟

(1.通化師范學(xué)院 生物系，吉林 通化 134002；2.東北師范大學(xué)，吉林 長春 130000)

黃芪抗衰老作用的研究以體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和血清藥理學(xué)方法為常見[1-2].黃芪多糖(astragalin polyose APS)為黃芪的主要成分，大量藥理及臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，APS具有抗衰老活性[3].本實(shí)驗(yàn)以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)材料，觀察了黃芪多糖不同濃度對(duì)其細(xì)胞分化及與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵基因表達(dá)的影響，為黃芪多糖抗衰老提供理論依據(jù).

1 材料與方法

材料：野生型斑馬魚由中國海洋大學(xué)生命科學(xué)院提供，在處理的前一天，將雌雄斑馬魚雌雄進(jìn)行分離，并與第二天上午進(jìn)行交配后收集魚卵，并在28℃條件下培養(yǎng)，取孵育8小時(shí)發(fā)育正常的斑馬魚幼胚置于24微孔板中，每一微孔板15只斑馬魚幼胚，設(shè)置三次重復(fù)，每一處理分別設(shè)置空白對(duì)照組、黃芪多糖低(0.125mg/ml)、中(0.25mg/ml)、高(0.5mg/ml)濃度進(jìn)行處理，每一天更換一次培養(yǎng)液，連續(xù)處理三天，搜集樣品，進(jìn)行染色及基因表達(dá)分析.

藥物及試劑:黃芪多糖純樣品購自陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司，β-半乳糖苷酶及吖啶購自Sigma公司.將10mg黃芪多糖溶于1ml孵育魚卵用的水溶液中(egg water)，制成10mg/ml儲(chǔ)存液，4℃保存.

樣品的采集與處理:取孵育8個(gè)小時(shí)發(fā)育正常的斑馬魚進(jìn)行藥物處理，每一處理濃度30個(gè)樣品，三次重復(fù)，連續(xù)處理三天，光學(xué)顯微鏡下觀察魚的生長發(fā)育狀態(tài).

樣品的SA-β-gal染色分析:取連續(xù)處理三天發(fā)育正常的斑馬魚樣品，PBS洗3～5次，4%paraformal-dehyde(PFA)4℃固定1～3天；PBS洗3～4次后PBS保存1～3天；然后PBS洗1次，加入染色液(25ul/ml)37℃培養(yǎng)16～24小時(shí)觀察照相.

樣品AO染色分析：取處理3天的樣品，放置在含200ug/ml的AO的溶液中.30℃條件下培養(yǎng)30分鐘，然后用孵育魚卵水溶液洗8次，每次5分鐘后，進(jìn)行觀察照相.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1黃芪多糖對(duì)斑馬魚生長發(fā)育的影響

給藥處理24h后，統(tǒng)計(jì)了各處理對(duì)斑馬魚存活的影響，結(jié)果見圖1.分析結(jié)果表明，黃芪多糖在0.125～0.25mg/ml對(duì)斑馬魚的發(fā)育影響不大，但當(dāng)黃芪多糖濃度高于0.5mg/ml時(shí)，斑馬魚的生存受到影響，與對(duì)照相比達(dá)到0.01顯著水平.此外，高濃度的黃芪多糖除引起斑馬魚高的致死率外，對(duì)斑馬魚的發(fā)育也產(chǎn)生了明顯的影響，在高黃芪多糖處理濃度下，斑馬魚表現(xiàn)為生長彎曲的畸形生長狀態(tài)(見圖2)，這也許是導(dǎo)致斑馬魚致死的主要原因.

圖1 黃芪多糖不同濃度對(duì)斑馬魚存活的影響。 圖2 (a)發(fā)育正常的斑馬魚，(b)生長畸形的斑馬魚

2.2黃芪多糖處理對(duì)斑馬魚衰老的影響

以往對(duì)黃芪抗衰老的作用實(shí)驗(yàn)表明，黃芪提取物能通過增加內(nèi)生性的抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性，穩(wěn)定細(xì)胞膜，從而減輕神經(jīng)細(xì)胞損害，延緩細(xì)胞衰老.SA-β-Gal陽性率能較好地反應(yīng)細(xì)胞群體或個(gè)體組織的老化速度，是反映衰老程度的重要生物學(xué)指標(biāo)，被廣泛應(yīng)用.黃芪多糖不同濃度處理斑馬魚的SA-β-Gal染色結(jié)果表明(圖3)，低濃度的黃芪多糖(0.125～0.25mg/ml)能有效干預(yù)斑馬魚胚胎發(fā)育細(xì)胞的衰老.然而在胚胎發(fā)育的早期的AO染色結(jié)果表明，各處理濃度對(duì)細(xì)胞早期的凋亡并沒有顯著影響(圖4).

圖3黃芪多糖處理對(duì)斑馬魚SA-β-Gal染色的影響(A SA-β-gal熒光統(tǒng)計(jì)分析圖；B SA-β-gal熒光染色圖a對(duì)照，b、c、d分別代表黃芪多糖濃度0.125mg/ml, 0.25mg/ml和0.5mg/ml)

圖4黃芪多糖處理對(duì)斑馬魚AO染色的影響(A AAO染色熒光統(tǒng)計(jì)分析圖；B AO熒光染色圖a對(duì)照，b、 、c d分別代表黃芪多糖濃度0.125mg/ml, 0.25mg/ml和0.5mg/ml)

3 討論

近年來延緩衰老以及老年病的預(yù)防已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的焦點(diǎn)，尋找有效地抗衰老藥物是衰老研究中的一個(gè)重要方面，由于化學(xué)藥物的廣泛使用及其毒副作用，研究的方向已矚目與傳統(tǒng)中藥.黃芪是最常用的“扶正固本，補(bǔ)中益氣”中藥之一，研究表明黃芪提取物及其有效成分可以減少自由基的過氧化作用，增強(qiáng)抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性，穩(wěn)定細(xì)胞膜，延緩細(xì)胞衰老.但以往的研究多集中在細(xì)胞水平上，在斑馬魚的研究上尚未見相關(guān)報(bào)道.斑馬魚繁殖能力強(qiáng)，適于大規(guī)模誘變育種，其體外受精和胚胎透明的特點(diǎn)使其便于觀察，此外，斑馬魚從受精卵開始到120小時(shí)，細(xì)胞增殖、遷移、分化，最終形成各種器官、組織，并且開始行使相應(yīng)的生理生化功能.這一階段，是斑馬魚基因作用的最活躍階段，也是斑馬魚胚胎發(fā)育過程中最重要階段，因此，斑馬魚作為新型模式動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)正在逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，它在遺傳學(xué)，發(fā)育生物學(xué)的研究中已被越來越廣泛的應(yīng)用[4].斑馬魚的神經(jīng)中樞系統(tǒng)、內(nèi)臟器官、血液以及視覺系統(tǒng)，在基因水平上87%與人類同源，早期發(fā)育與人類極為相似，已成為研究相關(guān)疾病基因的最佳模式生物.在國際上，斑馬魚模式生物的使用正逐漸拓展和深入生命體的多種系統(tǒng)(例如，神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等)的發(fā)育、功能和疾病(例如，神經(jīng)退行性疾病、遺傳性心血管疾病、糖尿病等)的研究中，并已用于小分子化合物的規(guī)模新藥篩選.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪多糖可以增強(qiáng)細(xì)胞活力，β-半乳糖苷酶活性下降，提示黃芪多糖在體內(nèi)有很好的抗衰老作用.

參考文獻(xiàn)：

[1]張鵬霞，樸金花，歐芹，等.黃芪對(duì)老年小鼠線粒體Mn-SOD，MDA及腦細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國老年學(xué)雜志，2003，23(9).

[2]李泓梅，等.黃芪血清藥理對(duì)人胚肺二倍體成纖細(xì)胞(HDF)抗衰老作用機(jī)制的研究[J].中國老年學(xué)雜志，2005，25(12).

[3]趙蓮芳，鄭玉淑，樸慧順，等.黃芪多糖及人參皂苷對(duì)衰老小鼠的抗衰老作用[J].延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)，2006，12(29).

[4]鄭麗麗，吳端生.斑馬魚實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化研究及應(yīng)用[J].南華大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2008，36(2).