熊果酸對(duì)HL60細(xì)胞作用機(jī)制的初步研究

李劍敏 周?chē)?guó)興 宋海鵬 何志軍 張斌

熊果酸(ursolic acid，UA)又名烏索酸、烏蘇酸，是廣泛存在于蘆筍、白花蛇舌草、女貞子、烏梅等天然植物和草藥中的五環(huán)三萜類(lèi)化合物，具有抗癌、抗炎、護(hù)肝、降血脂、降糖、抗氧化和抗病毒等多種生物學(xué)活性。近來(lái)研究表明，抗腫瘤活性是熊果酸最主要的藥理作用，抗腫瘤作用具有多方面和全方位等特點(diǎn)［1］。研究證明，熊果酸對(duì)肺癌細(xì)胞 A-549、胃癌SGC7901、白血病細(xì)胞P-388、L-1210和THP-1等均具有細(xì)胞毒性作用［2］，但其作用機(jī)制一直未明確。本實(shí)驗(yàn)擬用熊果酸干預(yù)處理人急性早幼粒白血病HL60細(xì)胞，體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究其對(duì)HL60細(xì)胞的增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡作用及機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 材料 急性早幼粒白血病HL60細(xì)胞由南華大學(xué)藥物藥理研究所惠贈(zèng)。UA為Sigma公司產(chǎn)品，用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，配制成1 mmol/L的濃縮液，凍存于-20℃，臨用前用培養(yǎng)基稀釋并調(diào)整DMSO終濃度為0.06%。四甲基偶氮唑藍(lán)［MTT］為Amresco公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HL60細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 增殖抑制實(shí)驗(yàn) HL60細(xì)胞以2×104/孔接種于96孔板，用 0、10、20、40 、80 μmol/L UA 分別處理 24、48、72 h 后，加入5 g/L MTT作用4 h。4℃離心，棄上清，加入DMSO振蕩溶解后，用熒光酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)下讀取吸光度值，以0 μmol/L UA組為對(duì)照組，計(jì)算增殖抑制率，增殖抑制率=［(對(duì)照組吸光度值-實(shí)驗(yàn)組吸光度值)/對(duì)照組吸光度值］×100%。

1.2.3 熒光顯微鏡細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 HL60細(xì)胞經(jīng)0、20、40、80 μmol/L UA 分別作用24 h后，800 g/min離心5 min，收集細(xì)胞，PBS洗滌，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至2×105個(gè)/ml，吹打均勻，取25 μl懸液加到載玻片上，加5 μl吖啶橙染色后置熒光顯微鏡(波長(zhǎng)250～350 nm)觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期相分布及細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 HL60細(xì)胞用0、20、40 、80 μmol/L UA 分別作用24 h，800 g/min離心5 min，收集5×106個(gè)細(xì)胞，預(yù)冷 PBS洗滌一次，加入70%預(yù)冷乙醇，4℃固定過(guò)夜。離心棄乙醇，PBS洗滌一次后加入RNA酶(1 mg/ml)200 μl，37℃水浴30 min后，加入 500 μl PI(50 mg/L)，4℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用t檢驗(yàn)P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn) MTT檢測(cè)顯示10～80 μmol/L UA對(duì)HL60細(xì)胞具有一定增殖抑制效果，且呈較明顯的濃度和時(shí)間依賴性(見(jiàn)圖1)，10、20 μmol/L UA對(duì)HL60細(xì)胞的作用微弱，40、80 μmol/L UA作用24 h后，HL60細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的增殖抑制。

圖1 UA對(duì)HL60細(xì)胞的增殖抑制作用

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的形態(tài)學(xué)變化 AO染色后，熒光顯微鏡下觀察，未用藥的細(xì)胞生長(zhǎng)良好，80 μmol/L UA作用24 h的HL60細(xì)胞可看到典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化(圖2):細(xì)胞染色質(zhì)濃縮，聚集于核邊緣形成塊狀或新月?tīng)?細(xì)胞體積縮小，核固縮深染，部分裂解形成凋亡小體。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率 UA作用24 h后，與對(duì)照組(0 μmol/L) 相比，40 μmol/L 、80 μmol/L UA 可使G0/G1期細(xì)胞增多，出現(xiàn)G0/G1期阻滯，S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)減少，凋亡細(xì)胞峰(Sub-G1)及凋亡率逐漸增高，凋亡率與對(duì)照組相比均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖3)。

圖2 熒光顯微鏡觀察UA作用24 h后HL60細(xì)胞的形態(tài)改變

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度UA作用24 h后HL60細(xì)胞的凋亡率

3 討論

熊果酸屬于α-香樹(shù)脂醇(α-amyrin)型五環(huán)三萜類(lèi)化合物，存在于許多植物中，具有廣泛的生物學(xué)活性，不僅對(duì)多種致癌、促癌物有抵抗作用，而且對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞有明顯細(xì)胞毒作用和誘導(dǎo)分化作用。樊明文等［3］研究表明，熊果酸通過(guò)抑制舌鱗癌細(xì)胞株TsCCa的增殖來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用;趙曉燕等［4］報(bào)道，熊果酸對(duì)胃癌BGC823細(xì)胞具有增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用;Cha HJ等［5］對(duì)侵襲性最強(qiáng)的HT1080纖維瘤細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)熊果酸可以通過(guò)胞漿內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體的移位下調(diào)人纖維肉瘤HT-1080細(xì)胞基質(zhì)金屬酶-9(MMP-9)基因的表達(dá)，從而降低纖維瘤的侵襲性。這些研究在一定程度上揭示了熊果酸的抗腫瘤效應(yīng)，但具體的抗瘤機(jī)制一直未得到明確。

本次研究以人急性早幼粒白血病HL60細(xì)胞為研究對(duì)象進(jìn)行體外培養(yǎng)，熊果酸干預(yù)處理，細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)(MTT)表明:10～80 μmol/L UA對(duì)HL60細(xì)胞具有一定增殖抑制效果，且呈濃度和時(shí)間依賴性。10、20 μmol/L UA對(duì)HL60細(xì)胞的作用微弱，40 μmol/L起開(kāi)始具有較明顯的作用。80 μmol/L UA作用24 h的HL60細(xì)胞AO染色后熒光顯微鏡下可看到典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化:細(xì)胞染色質(zhì)濃縮，聚集于核邊緣形成塊狀或新月?tīng)?細(xì)胞體積縮小，核固縮深染，部分裂解形成凋亡小體。UA處理24 h后，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示G0/G1期細(xì)胞增多，出現(xiàn)G0/G1期阻滯，S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)減少，凋亡細(xì)胞峰(Sub-G1)及凋亡率逐漸增高，說(shuō)明熊果酸體外可誘導(dǎo)HL60細(xì)胞發(fā)生凋亡來(lái)產(chǎn)生抗腫瘤活性。熊果酸誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的具體途徑可能是干擾了細(xì)胞信號(hào)通路中的某些環(huán)節(jié)有關(guān)，有待進(jìn)一步開(kāi)展更深層次的研究。

［1］夏國(guó)豪.熊果酸抗腫瘤作用研究進(jìn)展國(guó)外醫(yī)學(xué).腫瘤學(xué)分冊(cè)，2002，29(6):420-422.

［2］Lee KH，Lin YM，Wu TS，et al.The cytotoxic principles of Prunella vulgaris，Psychotria serpens and Hyptis capitata:Ursolic acid related derivatices.Planta Med，1998，54:308-311.

［3］樊明文，王茜，邊專(zhuān)，等.熊果酸對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞株TSCCa的抑制作用及其機(jī)制探討武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2004，25(1):1-3.

［4］趙曉燕，胡玉娜，康向東，等.熊果酸誘導(dǎo)人胃癌BGC823細(xì)胞凋亡及其作用機(jī)制初探中國(guó)癌癥雜志，2010，20(2):101-104.

［5］Cha HJ，Bae SK，Lee HY，et al.Anti invasive activity of ursolic acid correlateswith the reduced exp ression ofmatrixmet allop rotein2 ase-9(MMP-9)in HT1080 human fibrosarcoma cells.Cancer Res，1996，56(10):2281-2284.