復方血栓通膠囊微生物限度檢查法的驗證

王淡娜 趙春明

復方血栓通膠囊是國家火炬計劃重大項目的成果，是全國為數(shù)不多的單品種年銷售數(shù)億元的中成藥。復方血栓通膠囊由三七、黃芪、丹參、玄參經(jīng)科學方法提取有效成分制成;功效活血化瘀，益氣養(yǎng)陰;用于血瘀兼氣陰兩虛證的視網(wǎng)膜靜脈阻塞、穩(wěn)定性勞累型心絞痛等。由于功效顯著，應用廣泛，被載入《中國藥典》。復方血栓通膠囊為不含原藥粉的口服制劑，微生物限度檢查包括細菌、霉菌和酵母菌、控制菌中的大腸埃希菌。為了保證用藥安全，確立可靠的微生物限度檢驗方法，作者按照《中國藥典》微生物限度檢查方法[1]規(guī)定，對該品的微生物限度的檢查法進行了驗證?，F(xiàn)報告如下。

1 實驗材料

1.1 儀器及樣品 JYT-2架盤天平，LRH-150B型生化培養(yǎng)箱，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，MLS-3750高壓蒸汽滅菌器，潔凈工作臺，三角瓶，培養(yǎng)皿等。

復方血栓通膠囊(廣東眾生藥業(yè)股份有限公司100901101001 101201)

1.2 培養(yǎng)基稀釋劑及試劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基，改良馬丁培養(yǎng)基，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，膽鹽乳糖培養(yǎng)基和和對照培養(yǎng)基，4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基，pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液等，均來源于中國生物制品檢定所。

1.3 試驗用菌種 大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]，白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]，以上菌種均來源于中國生物制品檢定所，黑曲霉(Aspermlillus nimler)[CMCC(F)98003]菌種來源于廣東省藥品檢驗所。所有菌種均為不超5代的菌株。

2 方法和結(jié)果

2.1 細菌、霉菌及酵母菌檢查法的驗證

2.1.1 菌液的制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24 h;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24～48 h。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每1 ml含菌數(shù)約為50～100 cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5 d，加入5 ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含孢子數(shù)50～100 cfu的孢子懸液，備用。

2.1.2 供試液的制備 取樣品10 g，置已滅菌的三角瓶中，分別加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，混合均勻，制成1∶10的樣品稀釋液。平皿法直接取稀釋液為供試液。

2.1.3 培養(yǎng)基的適用性檢查 按照《中國藥典》(2010版)相關(guān)規(guī)定檢查，培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對照的菌落平均數(shù)的70%，形態(tài)大小與對照的一致，判定培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。

2.1.4 驗證方法

2.1.4.1 平皿(常規(guī))法

2.1.4.1.1 試驗組 取供試液1 ml和50～100 cfu的試驗菌各1 ml，分別注入平皿中立即傾注相應瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2份，按平皿法測定其菌數(shù)。

2.1.4.1.2 試驗菌液組 取已制備好含50～100 cfu的試驗菌液各1 ml分別注入平皿中，加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的試驗平皿立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，30～35℃培養(yǎng)3 d，計數(shù);加入白色念珠菌、黑曲霉的試驗平皿傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。23～28℃培養(yǎng)5 d，計數(shù)。每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。

2.1.4.1.3 供試品對照組 取供試液1 ml注入平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基15～20 ml，每種培養(yǎng)基平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。

2.1.4.2 培養(yǎng)基稀釋法

2.1.4.2.1 試驗組 取供試液1 ml分別等量注入五個平皿中，并分別加入50～100 cfu的試驗菌各1 ml，立即傾注相應瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2份，按培養(yǎng)基稀釋法測定其菌數(shù)。

2.1.4.2.2 試驗菌液組 取已制備好含50～100 cfu的試驗菌液各1 ml分別注入平皿中，加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的試驗平皿立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，30℃ ～35℃培養(yǎng)3 d，計數(shù);加入白色念珠菌、黑曲霉的試驗平皿傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。23℃ ～28℃培養(yǎng)5 d，計數(shù)。每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。

2.1.4.2.3 供試品對照組 取供試液1 ml分別等量注入五個平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20 ml，平行制備2份，按平皿法測定其菌數(shù)。

2.1.5 回收率計算

2.1.5.1 平皿法檢測的結(jié)果 金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌試驗組的回收率＜70%，表明該產(chǎn)品對金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌有抑菌活性作用，細菌檢查不適宜采用平皿法，細菌檢查應采用其他方法重新驗證;其余試驗組的回收率＞70%，霉菌及酵母菌檢查可采用平皿法。見表1。

2.1.5.2 培養(yǎng)基稀釋法檢測的結(jié)果 大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌試驗組的回收率均＞70%，見表2。表明該產(chǎn)品的抑菌活性消除，細菌數(shù)檢查可采用培養(yǎng)基稀釋法。

表1 常規(guī)平皿法(1∶10供試液)各試驗菌的回收率(cfu，%)

表2 培養(yǎng)基稀釋法(1→5)各試驗菌的回收率(cfu，%)

2.2 大腸埃希菌(控制菌)檢查法的驗證

2.2.1 菌液制備 取大腸埃希菌斜面培養(yǎng)基少許，接種5 ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置30～35℃培養(yǎng)24 h，取均勻培養(yǎng)物1 ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每1 ml含菌數(shù)約為10～100 cfu的菌懸液，在2～8℃保存，備用。

2.2.2 大腸埃希菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查 按照《中國藥典》(2010版)相關(guān)規(guī)定檢查，培養(yǎng)基的促生長能力、抑制能力和指示能力均符合要求，判培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定

2.2.3 驗證方法 試驗組:取1:10供試液10 ml和上述含10～100 cfu大腸埃希菌液1 ml;陽性對照組:取含10～100 cfu大腸埃希菌液1 ml;陰性對照組:取0.9%無菌氯化鈉溶液10 ml;分別加入盛有100 ml膽鹽乳糖增菌液的三角瓶中，培養(yǎng)24 h.分別取上述培養(yǎng)物0.2 ml，分別接種至含5 ml-MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，置30～35℃培養(yǎng)，于5 h，24 h在365 nm紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入5滴靛基質(zhì)試液，觀察液面顏色。結(jié)果詳見表3。從表3可以看出，試驗組、陽性對照組均檢出大腸埃希菌，陰性對照組為無菌生長。表明常規(guī)法檢出大腸埃希菌，供試液對大腸埃希菌無抑制作用，陰性供試液對本法無干擾，適用于該產(chǎn)品的大腸埃希菌檢查。

表3 大腸埃希菌驗證結(jié)果

3 討論

《中國藥典》2010版規(guī)定微生物限度檢查法中細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)計數(shù)驗證方法驗證的回收率應不低于70%，采用平皿法對復方血栓通膠囊驗證時，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌試驗組的回收率＜70%，其余試驗組的回收率＞70%。即該產(chǎn)品對金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌有抑制作用，不適宜采用平皿法檢查。在改用培養(yǎng)基稀釋法(1→5)后，大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌試驗組的回收率均＞70%。因此，檢查該品種的細菌數(shù)可考慮采用培養(yǎng)基稀釋法或其他方法。

[1]國家藥典委員會，中國藥典一部附錄.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:79-84.