藍萼甲素對人宮頸鱗癌SiHa細胞株生長抑制作用

夏 維，王修珍，蔣小崗，顧振綸，郭次儀

(1.蘇州中藥研究所，2.蘇州大學醫(yī)學部病理學與病理生理學系，江蘇蘇州 215123)

藍萼甲素(Glaucocalyxin A)是由唇形科香茶菜屬植物香茶菜Rabdosia amethystoieds(Benth)Ham中分離提取出的二萜化合物［1］。研究證明不同濃度的藍萼甲素可抑制某些腫瘤細胞的增殖，如肝癌 BEL-7402細胞株［2］、卵巢癌HO8910細胞株［3］，然而，藍萼甲素抑制腫瘤細胞增殖的機制尚未闡明。本文研究了藍萼甲素對人宮頸鱗癌SiHa細胞凋亡及其生長抑制作用，并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1材料藍萼甲素，上海艾匯生物科技有限公司(純度≥99.7%，批號:20100513)，溶于 DMSO 中配成50 mmol·L－1的母液;人宮頸鱗癌SiHa細胞株，中國科學院上海細胞生物學研究所。MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone)，MTT(噻唑藍)、DMSO(二甲基亞砜)、PI(碘化丙啶)、RNA 酶(Sigma公司)，Hoechst 33258染色試劑盒(上海碧云天生物公司)。

1.2方法

1.2.1細胞增殖抑制測定采用 MTT法檢測不同濃度的藍萼甲素(1.25、2.5、5、10、20 μmol·L－1)對 SiHa 細胞的毒性作用，570 nm處測吸光度值，實驗重復3次。

1.2.2Hoechst 33258染色法取對數(shù)生長期細胞，接種于24孔板中，次日待細胞貼壁后給予藍萼甲素濃度分別為2.5、5、10 μmol·L－1，對照組加新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng) 24 h 后按試劑盒操作步驟進行，熒光顯微鏡觀察、攝影。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞周期改變及凋亡率藍萼甲素處理細胞24 h后收集細胞，體積分數(shù)為70%的乙醇固定過夜，加入PI染色和RNA酶，37℃水浴30 min，用流式細胞儀檢測。

1.2.4RT-PCR檢測bax、bcl-2、caspase-3、caspase-9 mRNA表達應用Biozol體系，根據(jù)說明書步驟進行RNA提取。按TaKaRa試劑盒逆轉(zhuǎn)錄mRNA為cDNA。以GAPDH作為內(nèi)參，以PCR儀進行擴增。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件處理，多組比較采用方差分析法，實驗結(jié)果用±s表示。

2 結(jié)果

2.1藍萼甲素對SiHa細胞的生長抑制作用分析藍萼甲素對 SiHa細胞具有抑制增殖的作用，12、24、36、48、72 h 的IC50值分別為(17.33±1.90)、(6.84±0.41)、(4.27±0.55)、(2.96 ±0.62)、(1.98 ±0.91)μmol·L－1。隨著給藥濃度的增加，抑制率增加。給藥24 h后細胞抑制率分別為(10.89±2.08)%、(23.05±5.04)%、(42.77±2.14)%、(54.71±2.05)%、(81.96±0.46)%。表明藍萼甲素對Si-Ha細胞的增殖抑制作用呈明顯的時間－劑量依賴性。

2.2Hoechst 33258染色法觀察細胞的形態(tài)學變化分析熒光顯微鏡下觀察，對照組細胞核大，呈圓形或橢圓形，核內(nèi)熒光弱，且亮度均一，呈淡藍色。給藥24 h后可見細胞核體積減小，細胞核由于濃集而著色深，呈亮藍色，部分細胞核呈分葉、碎片狀或邊集，并隨著給藥濃度的增加，趨勢更加的明顯。

2.3流式細胞儀分析不同濃度(2.5、5、10 μmol·L－1)的藍萼甲素作用SiHa細胞24 h后，流式分析結(jié)果顯示G1峰前出現(xiàn)亞G1峰，并呈現(xiàn)明顯的S期周期阻滯(Tab 1)。

Tab 1 Effect of Glaucocalyxin A on SiHa cells by flow cytometric analysis

2.4RT-PCR檢測分析不同濃度(2.5、5、10 μmol·L－1)的藍萼甲素作用SiHa細胞24 h后，與對照組相比，隨著給藥濃度的增加 bcl-2 mRNA的表達下降(P＜0.01)，而 bax、caspase-3、caspase-9 mRNA的表達增加(P＜0.01)。

3 討論

本文研究發(fā)現(xiàn)藍萼甲素能明顯抑制人宮頸癌SiHa細胞增殖，且呈時間和劑量依賴性趨勢，流式細胞分析結(jié)果呈現(xiàn)明顯的sub-G1峰和S期周期阻滯，提示這種抑制與其誘導SiHa細胞凋亡和細胞阻滯于S期有關(guān)。

細胞凋亡的線粒體損傷的內(nèi)源性途徑通過活化caspase-9來激活凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者caspase-3［4］。激活的caspase-3裂解相應的胞質(zhì)胞核底物，導致細胞凋亡［5］。有文獻報道［6］bcl-2通過和caspase家族蛋白的作用來抑制凋亡的發(fā)生。bcl-2抗凋亡的機制主要有拮抗促凋亡基因bax，抑制促凋亡的蛋白質(zhì)細胞色素C的釋放，從而阻止細胞色素C激活caspase-3［7］。bax基因編碼的bax蛋白可以與bcl-2蛋白形成異二聚體，對bcl-2產(chǎn)生阻抑作用［8］。本實驗證明藍萼甲素能降低 SiHa細胞中 bcl-2 mRNA的表達，解除其對caspase-3的抑制，促進細胞的凋亡。本文RT-PCR分析結(jié)果顯示經(jīng)藍萼甲素處理后細胞的bcl-2 mRNA表達下降，而bax、caspase-3、caspase-9 mRNA表達增加，這說明藍萼甲素能通過下調(diào) bcl-2基因的表達，同時上調(diào) bax、caspase-3、caspase-9基因的表達，從而誘導細胞凋亡和S期阻滯來抑制SiHa細胞的生長。

綜上所述，藍萼甲素在體外明顯抑制人宮頸鱗癌SiHa細胞株的增殖，并通過下調(diào)bcl-2的表達和上調(diào)bax、caspase-3、caspase-9的表達來誘導細胞發(fā)生凋亡和周期阻滯。但其體內(nèi)作用機制與體外實驗是否一致以及臨床療效還有待進一步研究。

［1］Sun H D，Xu Y L，Jiang B.Diterpenoids fom isodon species［M］.Beijing:Sci Press，2001:93 －109.

［2］Ding L，Wang H，Liu G A，et al.A new ent-kaurane diterpenoid from Isodon excisoides［J］.J Chem Res，2004，10(5):697 －8.

［3］Wang B J，Won S J，Yu Z R，Su C L.Free radical scavenging and apoptotic effects of Cordyceps sinensis fractionated by supercritical carbon dioxide［J］.Food Chem Toxicol，2005，43(4):543 －52.

［4］Szegezdi E，Macdonald D C，Ni Chonghaile T，et al.Bcl-2 family on guard at the ER［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2009，296(5):C941－53.

［5］張 瓊，劉德育.蛇葡萄素改變Bcl-2/Bax表達和激活caspase-3誘導人肝癌細胞Bel-7402凋亡［J］.中國藥理學通報，2009，25(11):1502－3.

［5］Zhang Q，Liu D Y.Ampelopsin induces apoptosis via altering expression of Bcl-2/Bax and activating caspase-3 in human hepatoma cell line Bel-7402［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(11):1502－3.

［6］D'Amelio M，Tino E，Cecconi F.The apoptosome:emerging insights and new potential targets for drug design［J］.Pharm Res，2010，25(4):740 －51.

［7］Nidhish S，Misun H，Jery J，et al.Regulated cell death pathways:New twists in modulation of Bcl-2 family function［J］.Mol Cancer Ther，2009，8(6):1421 －9.

［8］Soriano M E，Scorrano L.The interplay between Bcl-2 family proteins and mitochondrial morphology in the regulation of apoptosis［J］.Adv Exp Med Biol，2010，687:97 －114.