秋水仙堿肝損傷機(jī)制探討

宋金萍，王 濤，陳雪梅，楊 潔，張富春，尚 靖

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830046;2.中國(guó)藥科大學(xué)新藥篩選中心，江蘇南京 210009)

秋水仙(Colchicum autumnaleL.)，百合科秋水仙屬多年生草本植物，是我國(guó)新疆維吾爾常用藥材，藥用部位多為球莖。主要成分為生物堿，秋水仙堿是已知其主要藥效和毒性成分，其余還包括2-去甲秋水仙堿，2-去甲脫羰秋水仙堿，2-去甲-17-羥基秋水仙堿，2-去甲-β-光秋水仙堿，β-光秋水仙堿等［1］。

秋水仙堿(colchicin，COL)主要用于治療急性痛風(fēng)以及痛風(fēng)的防預(yù)。近年來(lái)其臨床應(yīng)用又有所拓寬，發(fā)現(xiàn)其有抗腫瘤、抗纖維化活性，并對(duì)肝炎、心包炎、青光眼等疾病也有一定療效［2－3］。秋水仙堿治療劑量范圍窄，容易造成毒副作用。臨床主要不良反應(yīng)包括:胃腸道癥狀，肌肉、外周神經(jīng)病變，肝功能損害，骨髓抑制，休克，致畸，脫發(fā)、皮疹、發(fā)熱等。肝臟是秋水仙堿的主要代謝部位，也是毒性靶器官。秋水仙堿肝毒性機(jī)制尚不明確，本文旨在探討秋水仙堿的肝損傷機(jī)制。

1 材料和方法

1.1動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠，♀♂各半，體質(zhì)量(250±20)g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SCXK(軍)2007-0004;

1.2藥品與主要試劑秋水仙堿由南京澤郎公司提供(純度＞99%)，批號(hào):ZL201001010A;秋水仙總堿，棕黃色粉末(1 g總堿/200 g粗提物)，含量＞80%，自秋水仙粗提物分離提純，由新疆自治區(qū)維吾爾藥物研究所提供，經(jīng)HPLC測(cè)定秋水仙堿含量為9.7%。一抗:MRP2(M2Ⅲ-5):sc-59611;CYP7A1(H-58):sc-25536;BSEP(H-180):sc-25571;FXR(H-130):sc-13063均購(gòu) Santa Cruz。β-actin一抗:(A1978)購(gòu)自Sigma公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0010)，全蛋白提取試劑盒 RIPA裂解液(P0013B)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物飼養(yǎng)動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)內(nèi)〔動(dòng)物設(shè)施使用許可證號(hào):SYXK(蘇)2007-0017〕空氣潔凈度10 000級(jí)氣流速度(0.1 ～0.2)m·s－1，環(huán)境壓差(20～50)Pa，溫度(20～25)℃，濕度40% ～70%，氨濃度≤14 mg·m－3，換氣(10 ～20)次·h－1，明暗交替時(shí)間12 h/h，每籠5只，自由攝食和進(jìn)水。鼠全價(jià)顆粒飼料購(gòu)自江蘇協(xié)同生物醫(yī)藥工程有限公司。

1.3.2分組與給藥70只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(ig，0.5%CMC-Na)、對(duì)乙酰氨基酚組(ig，4-acetamidophenol 1.0 g·kg－1)、秋水仙堿組(ig，2、4、6 mg·kg－1)、秋水仙總堿組(ig，10、20 mg·kg－1)。各實(shí)驗(yàn)組大鼠每天連續(xù)灌胃染毒28 d。染毒期間每3天記錄各組大鼠的體重和攝食量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，股動(dòng)脈采血約8 ml，用于血清生化指標(biāo)的檢測(cè)?？焖俜蛛x大鼠肝臟并稱(chēng)重。取大鼠肝右大葉，經(jīng)10%中性甲醛固定后，進(jìn)行病理學(xué)檢查。剩余肝組織置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3血生化檢測(cè)指標(biāo)測(cè)定血清三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (AST)堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽汁酸(TBA)、總膽紅素(TBiL)、血糖(GLU)含量以評(píng)價(jià)肝功能。

1.3.4肝組織病理學(xué)檢測(cè)大鼠肝臟石蠟包埋，連續(xù)切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理改變。

1.3.5免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MRP2的表達(dá)變化免疫組織化學(xué)染色采用 HRP-Polymerase標(biāo)法，石蠟組織切片經(jīng)抗原暴露修復(fù)、血清封閉后，加入相應(yīng)第一抗體MRP2(M2Ⅲ-5):sc-59611(1∶100)，第二抗體(1∶3 000)，進(jìn)行肝組織原位檢測(cè)MRP2表達(dá)量變化。

1.3.6肝組織蛋白樣品制備按照碧云天全蛋白提取法提取肝組織蛋白。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白含量。蛋白變性后，用Western blot檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá)量。

1.3.7Western blot檢測(cè)FXR、BSEP、CYP7A1蛋白表達(dá)變化上述制備好的蛋白樣品，進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳，蛋白上樣量為60 μg。按分子量大小不同，制備不同濃度凝膠。電泳條件為80 V，30 min;120 V，80 min。濕轉(zhuǎn)條件為0.32 A，3 h。一抗稀釋比例，CYP7A1(1 ∶300)，BSEP(1 ∶300)，F(xiàn)XR(1∶300)。凝膠成像儀曝光30 min，并進(jìn)行灰度掃描分析。

1.3.8數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)用±s表示，組間的差異性分析采用單因素方差(oneway-ANOVO)和組間t檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1秋水仙堿對(duì)大鼠體重和肝臟臟器指數(shù)的影響與正常對(duì)照組比較，染毒給藥3 d后，秋水仙堿6 mg·kg－1、秋水仙總堿 20 mg·kg－1和陽(yáng)性藥對(duì)乙酰氨基酚組大鼠體質(zhì)量明顯下降;其余染毒組大鼠體重增長(zhǎng)正常(Fig 1)。與正常組相比，除秋水仙總堿10 mg·kg－1，其余各染毒組大鼠肝重/體重指數(shù)均明顯升高(Tab 1)。

2.2秋水仙堿對(duì)大鼠血生化指標(biāo)的影響與正常對(duì)照組相比，除秋水仙總堿10 mg·kg－1組，其余各組血清ALT活性均明顯升高。對(duì)乙酰氨基酚組，ALP、TBA水平也明顯增加，ALB、TP和GLU水平均正常。秋水仙堿6 mg·kg－1組血清ALB和TP含量均明顯降低，而ALP活性和TBA含量明顯升高。秋水仙總堿組，血糖水平偏高，其余指標(biāo)無(wú)明顯變化(Tab 2)。

Tab 1 Effect of COL，TA(ig，28 d)on liver weight and liver index of intoxicated rats(±s，n=10)

Tab 1 Effect of COL，TA(ig，28 d)on liver weight and liver index of intoxicated rats(±s，n=10)

COL:colchicines;TA:total alkaloid extract of Colchicum autumnale L;APAP:4-Acetamidophenol.*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs control group.

Control 0.5%CMC-Na 348.8 ±22.8 9.7 ±0.6 2.70 ±0.15 APAP 1000 306.0 ±16.5＊＊14.7 ±0.9* 4.80 ±0.15*COL 2 332.5 ±1.5 10.0 ±0.3 2.90 ±0.10*4 338.3 ±7.6 10.9 ±0.6 3.20 ±0.09＊＊6 313.0 ±14.0＊＊10.3 ±0.8 3.30 ±0.26＊＊TA 10 337.6 ±14.9 9.1 ±0.6 2.70 ±0.02 20 306.1 ±19.7＊＊ 8.9 ±0.7 3.30 ±0.26＊＊

Fig 1 Effect of COL，TA(ig，28 d)on body weight of intoxicated rats(±s，n=10)

Tab 2 Effect of COL，TA on the blood biochemistry in rat(±s，n=10)

Tab 2 Effect of COL，TA on the blood biochemistry in rat(±s，n=10)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group

Group Dose/mg·kg－1 ALT/U·L－1 ALP/U·L－1 TBA/μmol·L－1 Glucose/mmol·L －1 Control 0.5%CMC-Na 49.0 ±12.1 93.3 ±27.2 35.8±30.4 4.3 ±0.8 APAP 1000 3051.9 ±302.1＊＊ 210.8 ±46.2* 196.7 ±118.5 4.7 ±0.3 COL 2 88.1 ±14.5* 139.2 ±17.4 43.6 ±25.7 5.6 ±0.4 4 99.4 ±22.3* 133.4 ±21.3 20.4 ±14.5 5.4 ±0.4 6 134.9 ±23.8＊＊ 223.2 ±41.5* 93.1 ±21.3* 4.6 ±0.9 TA 10 57.7 ±7.1 84.3 ±7.4 29.5 ±6.4 6.8 ±0.7*20 77.9 ±8.2* 90.4 ±22.6 27.5 ±4.9 5.6 ±0.6*

Fig 2 Effects of COL，TA on pathological impairment of liver tissue in intoxicated rats(HE)

2.3大鼠肝臟組織病理學(xué)改變?cè)诠忡R下可以觀察到，正常組大鼠肝細(xì)胞排列整齊，中央靜脈和匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常。對(duì)乙酰氨基酚組大鼠肝凝固性壞死，纖維組織增生 )，肝內(nèi)有假小葉結(jié)構(gòu)，肝內(nèi)淤膽，小膽管纖維增生，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。秋水仙堿2 mg·kg－1和4 mg·kg－1組在組織水平未見(jiàn)明顯病變。秋水仙堿6 mg·kg－1組，大鼠肝臟可見(jiàn)多處灶性壞死(?)，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(→)，并伴有嚴(yán)重的肝細(xì)胞水腫。秋水仙總堿10 mg·kg－1組，大鼠肝臟也未觀察到明顯病變。秋水仙總堿20 mg·kg－1組大鼠肝臟也發(fā)現(xiàn)小灶性壞死細(xì)胞，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有嚴(yán)重的脂肪變性(?)，結(jié)果見(jiàn)Fig 2。

2.4秋水仙堿對(duì)大鼠肝臟組織MRP2表達(dá)的影響MRP2在肝細(xì)胞質(zhì)膜表達(dá)，著棕紅色，為陽(yáng)性信號(hào)。與正常對(duì)照組相比，對(duì)乙酰氨基酚組和秋水仙堿6 mg·kg－1組MRP2陽(yáng)性細(xì)胞率均降低，且質(zhì)膜著色區(qū)域少。總堿20 mg·kg－1組，陽(yáng)性細(xì)胞率和質(zhì)膜著色區(qū)域無(wú)區(qū)別，結(jié)果見(jiàn)Fig 3。

2.5秋水仙堿對(duì)大鼠肝臟膽汁酸合成酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)量的影響與正常對(duì)照組相比，秋水仙堿6 mg·kg－1組和對(duì)乙酰氨基酚組的變化趨勢(shì)一致，均能誘導(dǎo)FXR明顯下調(diào)，CYP7A1明顯上調(diào)，BSEP表達(dá)也有所下調(diào)，灰度分析結(jié)果見(jiàn)Fig 4。

3 討論

本研究結(jié)果表明，SD大鼠灌服染毒28 d 6 mg·kg－1秋水仙堿和20 mg·kg－1秋水仙總堿提取物可導(dǎo)致肝細(xì)胞功能損傷，肝組織病變。與正常對(duì)照組相比，6 mg·kg－1秋水仙堿和20 mg·kg－1秋水仙總堿提取物均可誘導(dǎo)ALT活性明顯升高。但是與20 mg·kg－1秋水仙總堿提取物組相比，秋水仙堿6 mg·kg－1組ALT活性約是其2倍;肝組織灶性壞死，肝細(xì)胞水腫和脂肪變性程度比其嚴(yán)重。

同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)，與對(duì)乙酰氨基酚組一致，秋水仙堿組的大鼠血清ALP和TBA水平均明顯升高。由此提示我們，秋水仙堿和對(duì)乙酰氨基酚對(duì)肝臟中膽汁酸合成及轉(zhuǎn)運(yùn)通路中的相關(guān)靶標(biāo)蛋白的表達(dá)可能有影響。

Fig 3 Immunohistochemical detection of MRP2 in livers of rats treated with COL，TA(400×)

Fig 4 Western blot detection of CYP7A1，BSEP，F(xiàn)XR in livers of rats treated with COL，TA

肝臟中膽汁酸主要由CYP7A1啟動(dòng)并限速的經(jīng)典途徑合成［4］。在體內(nèi)，F(xiàn)XR與異源二聚體伴侶(SHP)結(jié)合為復(fù)合體，可以直接作用于CYP7A1的啟動(dòng)子，抑制CYP7A1的轉(zhuǎn)錄，從而抑制膽汁酸的合成［5－6］。

肝細(xì)胞上膽汁酸主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是MRP2和BSEP。MRP2參與的膽汁排泌是肝臟膽汁形成的主要過(guò)程和限速步驟［7］。研究表明MRP2基因突變是導(dǎo)致肝內(nèi)膽汁淤積的主要原因之一?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)ABCB11基因的某些變異導(dǎo)致BSEP的低表達(dá)會(huì)使人們對(duì)藥物誘導(dǎo)的肝內(nèi)膽汁淤積的易感性增加［8－9］。研究還證實(shí)FXR對(duì)MRP2和BSEP都具有正調(diào)控作用［10－14］。

研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，秋水仙堿6 mg·kg－1組和對(duì)乙酰氨基酚組大鼠肝臟FXR表達(dá)量明顯下降，同時(shí)CYP7A1表達(dá)升高，BSEP表達(dá)有所降低(Fig 4)。免疫組化檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)，和正常對(duì)照組比較，秋水仙堿6 mg·kg－1組和乙酰氨基酚組大鼠肝臟中的MRP2蛋白表達(dá)均下調(diào)(Fig 2)。

因此推斷，秋水仙堿引起大鼠肝臟損傷時(shí)抑制了核受體FXR的表達(dá)，致使肝細(xì)胞中膽汁酸負(fù)反饋調(diào)控失控，CYP7A1過(guò)表達(dá)，膽酸合成失衡。同時(shí)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP2和BSEP的表達(dá)下調(diào)，更加劇了肝細(xì)胞內(nèi)大量膽酸對(duì)肝細(xì)胞的細(xì)胞毒性。肝細(xì)胞淤膽損傷條件下，膽酸會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)至血管，再經(jīng)腎臟排泄，以減輕對(duì)肝臟的損傷。但是在病理?xiàng)l件下，秋水仙堿對(duì)膽汁合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的干預(yù)機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。

研究結(jié)果顯示，秋水仙堿和秋水仙總堿提取物的大鼠28 d灌服給藥均可引起肝損傷，但肝損傷程度和機(jī)制有差別。①在本實(shí)驗(yàn)的用藥劑量下，秋水仙堿和秋水仙總堿提取物比較，秋水仙堿對(duì)大鼠肝功能和肝組織損傷更為嚴(yán)重。②秋水仙堿和對(duì)乙酰氨基酚，都可誘導(dǎo)大鼠血清TBA和ALP水平明顯升高，肝毒性特征為膽汁淤積;且均誘導(dǎo)FXR、BSEP和MRP2表達(dá)降低，CYP7A1表達(dá)上調(diào)，因此推斷二者引起大鼠肝細(xì)胞內(nèi)膽汁淤積的機(jī)制相似。

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