霉酚酸酯對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠血CD4+CD25+T細胞的影響

朱正禹，謝兆宏，由 瑋，畢建忠，王 萍

(山東大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東濟南 250033)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的炎性脫髓鞘性疾病，其病因和發(fā)病機制復(fù)雜，一般認為是遺傳易感個體與環(huán)境因素相互作用而發(fā)生的自身免疫性疾病，以髓鞘脫失、神經(jīng)膠質(zhì)增生、不同程度的軸索病變和進行性神經(jīng)功能紊亂為主要特點［1］。實驗性自身免疫性腦脊髓炎 (experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的病理學(xué)、免疫學(xué)和臨床表現(xiàn)與MS極為相似，是公認的研究MS免疫病理學(xué)機制及其實驗性治療的最佳動物模型［2］。CD4+CD25+T細胞是調(diào)節(jié)性T細胞的亞群之一，能抑制自身反應(yīng)性T、B細胞的活化增殖以及免疫球蛋白的產(chǎn)生［3］。大量的實驗表明CD4+CD25+T細胞的減少或功能降低會導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)是一種選擇性抑制T、B淋巴細胞增生的新型免疫抑制劑，副作用小，現(xiàn)臨床主要用于預(yù)防器官移植的急慢性排斥反應(yīng)［4］，及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的治療［5］。本研究采用EAE大鼠作為動物模型，給予不同劑量MMF及甲基強的松龍治療，觀察藥物緩解大鼠臨床癥狀的效果及對大鼠血CD4+CD25+T細胞的影響，探討MMF治療EAE的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康♀ Wistar大鼠50只，體質(zhì)量180～220 g，6～8周齡，由山東大學(xué)實驗動物中心提供;健康♀ 豚鼠15只，體質(zhì)量350～400 g，由濟南中興旺養(yǎng)殖中心提供。均于山東大學(xué)第二醫(yī)院實驗動物中心動物房在恒溫22℃、相對濕度0.65～0.70、光照周期12 h環(huán)境中，用標準混合飼料(由山東大學(xué)實驗動物中心提供)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進入實驗。

1.1.2主要試劑與儀器霉酚酸酯購自上海羅氏制藥有限公司;甲基強的松龍購自大連輝瑞制藥有限公司;百日咳桿菌抗原購自中國藥品生物制品檢定所;CD4-FITC單標抗體、CD4-FITC/CD25-PE雙標抗體以及相應(yīng)的對照抗體由美國BD公司提供;流式細胞儀由美國BD公司提供。

1.2方法

1.2.1EAE大鼠模型制備

1.2.1.1完全抗原的制備 取液體石蠟40 ml、羊毛脂20 g混合，加熱并融化制得不完全弗氏佐劑(Incomplete Freund Adjuvant，IFA)，分裝入 10 ml小瓶高壓滅菌后4℃冰箱保存。豚鼠用體積分數(shù)為0.1的水合氯醛 350 mg·kg－1腹腔注射至四肢癱軟，無菌狀態(tài)下剪開胸腔、剝離心包，質(zhì)量濃度為0.009生理鹽水左心室灌注直至肝臟變白，迅速取其脊髓，小心剝離脊膜后稱重，加入等量生理鹽水，制成體積分數(shù)為0.5(W/V)的全脊髓勻漿(guinea pig spinal cord homogenate，GPSCH)。同時融化 IFA，1 ml IFA加入約10 mg的卡介苗，即制得完全弗氏佐劑(Complete Freund Adjuvant，CFA)。將 CFA 與 GPSCH等體積混合，在冰上用注射器反復(fù)抽推，制成油包水乳液，制成完全抗原，放置冰上備用。

1.2.1.2模型制備 健康♀ Wistar大鼠50只，隨機取6只作為正常對照組，其余44只造模。44只大鼠四肢足墊皮下及頸部皮下分別注射完全抗原(GPSCH/CFA)0.1 ml，即0.5 ml/只，足背皮內(nèi)注射百日咳桿菌抗原0.01 ml/只(含3.0×109個菌體);6只對照大鼠四肢足墊皮下及頸部皮下分別注射等量的生理鹽水/CFA乳液。免疫當日記為0 d。

1.2.2動物模型鑒定

1.2.2.1神經(jīng)功能評分 免疫當日和免疫后所有動物每日進行神經(jīng)功能評分(Duckers評分)［6］0分:不發(fā)病;1分:尾部張力降低或輕度步態(tài)笨拙;2分:尾部無張力和(或)后肢中度無力;3分:雙側(cè)后肢麻痹;4分:后肢麻痹伴前肢力弱或麻痹;5分:因EAE而瀕臨死亡或死亡。評分≥1分為造模成功。

1.2.2.2腦、脊髓組織病理檢查 模型大鼠采用體積分數(shù)為0.1的水合氯醛腹腔麻醉后灌注處死。分別取脊髓頸膨大、胸段、腰膨大及全腦，體積分數(shù)為0.04的多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋、切片，HE染色后光鏡觀察。

1.2.3動物分組及藥物治療方法造模成功且存活的大鼠共25只，與6只對照大鼠共分為5組，在實驗d 15給藥。MMF大劑量組(n=6)給予30 mg·kg－1·d－1灌胃;MMF 小劑量組(n=6)給予 20 mg·kg－1·d－1)灌胃;甲基強的松龍組(n=6)給予30 mg·kg－1·d－1尾靜脈注射;模型組(n=7)及正常對照組(n=6)每天給予等量生理鹽水灌胃。給藥時間均為14 d。

1.2.4監(jiān)測指標

1.2.4.1神經(jīng)功能評分 給藥后每天觀察記錄神經(jīng)功能評分。

1.2.4.2血 CD4+CD25+T細胞比例觀察 在實驗d 29，將大鼠以水合氯醛腹腔麻醉后，心臟穿刺取血，EDTA抗凝并在6 h內(nèi)進行分析;用FITC標記的抗CD4單抗、CD4-FITC/CD25-PE雙標抗體進行熒光抗體標記后，利用流式細胞儀檢測CD4+T細胞、CD4+CD25+T細胞的百分數(shù)。

1.2.4.3腦、脊髓組織病理檢查 心臟取血后立即心臟灌注處死動物，取脊髓及全腦，HE染色后光鏡觀察。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0軟件行方差分析，數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果

2.1EAE模型成功率及神經(jīng)功能評分經(jīng)生理鹽水/CFA免疫的6只對照大鼠未出現(xiàn)癥狀，體重持續(xù)增長，活動度正常。經(jīng)完全抗原免疫的44只大鼠有32只發(fā)病，其中1分:8只;2分:7只;3分:7只;4分:3只;5分:7只，發(fā)病率為72.1%。麻醉意外及免疫后急性期死亡4只，評分5分的大鼠在發(fā)病達高峰時死亡。造模成功且存活的大鼠為25只，免疫后d 12首例出現(xiàn)臨床癥狀，以后發(fā)病數(shù)逐漸增多，多數(shù)在d 12～15出現(xiàn)癥狀，癥狀出現(xiàn)后d 3～4發(fā)病達高峰。癥狀先表現(xiàn)為尾部張力減低，隨后出現(xiàn)活動減少，食欲不振，體重明顯下降，毛色晦暗，雙后肢麻痹，嚴重者發(fā)展為四肢癱瘓，喂食時咀嚼無力，不能進水，尿便障礙至瀕臨死亡。

2.2治療后EAE模型大鼠的神經(jīng)功能評分實驗d 17即有治療組EAE大鼠臨床癥狀出現(xiàn)緩解，后緩解大鼠逐漸增多，大鼠麻痹、癱瘓的四肢逐漸恢復(fù)，攝食攝水量增多，活動增加甚至活動靈敏度接近正常。模型組大鼠癥狀多在實驗d2 0后開始緩解，緩解時間拖后，緩解速度及程度均較治療組小。隨著臨床癥狀的緩解，EAE模型大鼠體重也逐漸增加。見Tab 1。

Tab 1 Duckers scores of the rats after treatment(±s)

Tab 1 Duckers scores of the rats after treatment(±s)

▲▲P ＜0.01 vs model group;★P ＜0.05 vs Methylprednisolone group.

Group n Duckers score 15 d 18 d 21 d 24 d 27 d Control 6 0 0 0 0 0 Model 7 2.1 ±1.0 2.6 ±1.1 2.9 ±1.2 2.0 ±1.1 2.0 ±1.2 Methylprednisolone 6 2.0 ±1.2▲▲ 1.8 ±1.1▲▲ 1.6 ±0.9▲▲ 1.4 ±0.8▲▲ 1.2 ±1.1▲▲Low dose of MMF 6 2.1 ±1.1▲▲ 1.8 ±0.9▲▲ 1.5 ±1.0▲▲ 1.3 ±1.1▲▲ 1.1 ±1.3▲▲High dose of MMF 6 2.0 ±1.4▲▲★ 1.7 ±1.0▲▲★ 1.4 ±1.2▲▲★ 1.0 ±0.9▲▲★ 0.8 ±1.2▲▲★

2.3病理學(xué)改變造模成功的EAE大鼠組織病理學(xué)主要表現(xiàn)為神經(jīng)髓鞘腫脹、崩解、脫失。腦部的病灶主要分布于白質(zhì)內(nèi)，腦室周圍多見，呈不規(guī)則形，以小靜脈為中心，周圍為多層炎細胞浸潤，形成“血管套”樣改變。脊髓的損害較腦為重，以腰骶段最為明顯，白質(zhì)較灰質(zhì)明顯。對照組的神經(jīng)組織病理檢查未見異常，這與此組未出現(xiàn)臨床癥狀吻合。治療后各組大鼠腦和脊髓組織病理學(xué)改變與模型組相比，均有不同程度減輕，病灶區(qū)域的炎性浸潤細胞數(shù)及“血管套”樣改變明顯少于模型組，以MMF大劑量組改變最明顯(Fig 1)。

2.4各組血CD4+T細胞、CD4+CD25+T細胞的百分率比較與對照組相比EAE大鼠血CD4+T細胞百分數(shù)明顯增加(P＜0.01);與模型組相比，經(jīng)MMF及甲基強的松龍治療的各組血CD4+T細胞百分數(shù)均下降，其中 MMF大劑量組療效明顯優(yōu)于MMF小劑量組和甲基強的松龍組(P＜0.01);與模型組相比，治療后各組EAE大鼠血CD4+CD25+T細胞比例均提高，且MMF大劑量組比MMF小劑量組和甲基強的松龍組增高明顯，差異有顯著性(P＜0.01)，MMF小劑量組和甲基強的松龍組差異無顯著性。見Tab 2，F(xiàn)ig 2。

Tab 2 Percentage of blood CD4+T cells，CD4+CD25+T cells of the rats after treatment(%，±s)

Tab 2 Percentage of blood CD4+T cells，CD4+CD25+T cells of the rats after treatment(%，±s)

▲▲P＜0.01 vs control group;★★P＜0.01 vs model group;◆◆P＜0.01 vs Methylprednisolone group

▲▲★★◆◆

Fig 1 HE staining of spinal cord myelin(×200)

Fig 2 Percentage of blood CD4+CD25+T cells of the rats after treatment

3 討論

EAE具有與人類MS極為相似的病理學(xué)、免疫學(xué)和臨床特征，是研究MS的理想動物模型［7］。本實驗采用我國常見的Wistar♂大鼠來制作EAE動物模型，造模成功率為72.1%，與李勇等［8］的報道(40% ～50%)相比發(fā)病率較高，可能與造模季節(jié)、動物品系、卡介苗用量、百日咳桿菌的濃度、免疫部位及完全抗原的注射量均有關(guān)。造模成功后腦脊髓組織切片HE染色可見急性血管炎伴周圍髓鞘脫失，小靜脈周圍有大量炎細胞浸潤，形成“血管套”，白質(zhì)多于灰質(zhì)，與國內(nèi)外報道基本一致。

在MS發(fā)病機制及病情演化中，細胞免疫與體液免疫均參與了病理免疫過程，免疫異常及免疫細胞的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)紊亂是其發(fā)病的機制，因此應(yīng)用免疫抑制類藥物是MS治療的主要手段，目前尚無理想藥物。MMF是霉酚酸(MPA)的2－乙基酯類衍生物，主要藥理作用抑制淋巴細胞與單核細胞增殖，減少抗體的產(chǎn)生，抑制細胞表面黏附分子的合成發(fā)揮抗炎作用［9］。MMF比其他常規(guī)應(yīng)用的免疫抑制劑(如環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤等)具有更小細胞毒性的優(yōu)勢。MMF起初用于移植后免疫排斥反應(yīng)，現(xiàn)在越來越多地用于治療結(jié)締組織病及神經(jīng)免疫性疾病如重癥肌無力、多發(fā)性神經(jīng)病等，亦有聯(lián)合干擾素-β 1a(interferon beta 1a)治療MS的臨床試驗顯示MMF具有良好的治療作用及耐受性［10］。

CD4+CD25+T細胞是一類調(diào)節(jié)性細胞，是在胸腺細胞正常分化時由CD4+CD8+雙陽性細胞向CD4+CD8－單陽性細胞轉(zhuǎn)變過程中形成的，在抑制自身反應(yīng)性細胞增殖、維持免疫環(huán)境的穩(wěn)定方面起著重要作用。CD4+CD25+T細胞數(shù)量的減少、抑制功能的受損和(或)表面分子表達的缺陷，都可能導(dǎo)致自身免疫病的發(fā)生。McGeachy等［11］報道CD4+CD25+T細胞的減少會阻礙EAE模型大鼠的自然恢復(fù)過程，同時還發(fā)現(xiàn)如果模型大鼠恢復(fù)后再人為減少CD4+CD25+T細胞數(shù)則會導(dǎo)致EAE復(fù)發(fā)，接受中樞神經(jīng)源性CD4+CD25+T細胞移植的大鼠則不會被誘導(dǎo)成為EAE模型。

本研究發(fā)現(xiàn)與模型組相比，治療組大鼠神經(jīng)功能評分均有所下降，腦和脊髓組織病理學(xué)改變均有不同程度減輕，MMF大劑量組療效優(yōu)于MMF小劑量組和甲基強的松龍組。與對照組相比，各組EAE大鼠CD4+T細胞比例均增加(P＜0.01)，治療后EAE大鼠CD4+T細胞比例下降，MMF大劑量組比MMF小劑量組和甲基強的松龍組降低更明顯，差異有顯著性(P＜0.01);與模型組相比，治療后各組大鼠血CD4+CD25+T細胞均有所提高，且MMF大劑量組比MMF小劑量組和甲基強的松龍組增高明顯，差異有顯著性(P＜0.01)，MMF小劑量組和甲基強的松龍組差異無顯著性。推測EAE發(fā)病可能與CD4+T細胞增生、CD4+CD25+T細胞比例減少有關(guān)。實驗結(jié)果表明，MMF作為一種免疫調(diào)節(jié)劑可以抑制CD4+T細胞增殖，降低CD4+T細胞百分數(shù)，同時可誘導(dǎo) CD4+CD25+T細胞百分數(shù)增加，修補EAE大鼠的免疫缺陷，使其免疫系統(tǒng)更好的處理自身反應(yīng)的淋巴細胞。其機制可能與細胞間直接接觸及抑制性細胞因子IL-10、TGF-β等的參與有關(guān)，也可能是通過激活轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，增強CD4+CD25+T細胞活性來實現(xiàn)的，具體機制有待進一步闡明。本實驗為探索EAE發(fā)病的特點及免疫抑制劑治療MS提供了新的實驗依據(jù)。

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