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      凹頂藻萜提取物對(duì)荷H22腫瘤小鼠氧化應(yīng)激及p53和 MMP-9表達(dá)的影響

      2011-05-31 08:49:10張文卿馬愛國(guó)
      關(guān)鍵詞:萜類突變型試劑盒

      梁 惠,劉 穎,韓 磊,賀 娟,張文卿,馬愛國(guó)

      (1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院營(yíng)養(yǎng)研究所,山東 青島 266021;2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266071;3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科,山東青島 266003;4.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266071)

      肝癌是嚴(yán)重危害人類生命健康的頑癥之一。近年來(lái),海洋萜類化合物的天然抗氧化、抗腫瘤活性已引起人們的廣泛關(guān)注[1]。凹頂藻是海洋萜類化合物的重要來(lái)源,課題組前期已從三列凹頂藻中成功獲得總萜含量為63.3%的凹頂藻萜提取物,并進(jìn)行一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),獲得了可喜的研究結(jié)果[2-4]。但目前關(guān)于凹頂藻萜類化合物對(duì) H22腫瘤p53和MMP-9表達(dá)及氧化應(yīng)激水平的影響,國(guó)內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以凹頂藻萜提取物為干預(yù)物,觀察其對(duì)小鼠H22腫瘤的抑制作用,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

      1 材料與方法

      1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及瘤株清潔級(jí)昆明小鼠,18~23 g,♂,由青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。H22小鼠肝癌細(xì)胞株,由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所引進(jìn)。

      1.2主要試劑凹頂藻萜提取物(LTE),為本實(shí)驗(yàn)室所有;兔抗小鼠突變型p53抗體、MMP-9抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司);免疫組化試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司);SOD及MDA檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所);

      1.3動(dòng)物模型的建立40只昆明小鼠隨機(jī)分為模型組、LTE低、中、高劑量干預(yù)組。于小鼠左前肢腋窩皮下接種2×109·L-1的H22肝癌細(xì)胞懸液0.2 ml。24 h后,模型組給予大豆色拉油0.5 ml·d-1灌胃;LTE低、中、高劑量干預(yù)組給予大豆色拉油稀釋的 LTE 溶液 25、50、100 mg·kg-1·d-10.5 ml灌胃;各組均連續(xù)給藥2周,觀察小鼠生長(zhǎng)情況。

      1.4樣品采集末次給藥24 h后,小鼠腹主動(dòng)脈取血,肝素抗凝,用于抗氧化指標(biāo)檢測(cè)。完整剝離腫瘤,計(jì)算抑瘤率。抑瘤率/%=(對(duì)照組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量)/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100%。

      1.5LTE對(duì)小鼠H22腫瘤組織中突變型p53和MMP-9表達(dá)的影響取上述各組小鼠新鮮腫瘤組織常規(guī)做石蠟切片,按照SP免疫組化試劑盒說明書操作。

      1.6LTE對(duì)H22小鼠血漿過氧化指標(biāo)的影響按照試劑盒說明書操作。

      1.7LTE對(duì)紅細(xì)胞溶血度的影響采用比色法檢測(cè)。

      1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

      2 結(jié)果

      2.1實(shí)驗(yàn)小鼠成瘤情況模型組小鼠腫瘤生長(zhǎng)潛伏期(TT)短,2 d即可成瘤,且生長(zhǎng)迅速。與模型組比較,LTE各劑量組小鼠TT達(dá)到3~4 d,腫瘤生長(zhǎng)緩慢。各組小鼠成瘤率為100%。

      2.2LTE對(duì)H22小鼠腫瘤質(zhì)量的影響模型組小鼠腫瘤質(zhì)量較大,達(dá)到(2.68±0.86)g;LTE各組小鼠H22腫瘤生長(zhǎng)均明顯受到抑制,分別達(dá)到(1.94±0.52)、(1.74±0.65)和(1.56±0.44)g,與模型組比較,差異有顯著性(P<0.05)。且隨著藥物劑量的增加,抑瘤率逐漸升高,分別達(dá)到27.5%、34.9%和41.4%,具有量效依賴趨勢(shì)。

      2.3LTE對(duì)小鼠H22腫瘤組織中突變型p53和MMP-9表達(dá)的影響LTE高劑量組突變型p53和MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率下降,與模型組比較,差異具有顯著性(P<0.05)。見Tab 1。

      Tab 1 Effect of LTE on expression of p53 and MMP9 in H22 mice(±s)

      Tab 1 Effect of LTE on expression of p53 and MMP9 in H22 mice(±s)

      *P<0.05 vs model group

      Group n Dose/mg·kg-1·d -1 Positive rate/%p53 MMP-9 Model 9 0.00 42.5 ±1.31 75.1 ±2.68 LTE 9 25.00 35.6 ±1.69 65.9 ±1.52 8 50.00 30.1 ±1.74 42.6 ±1.36*7 100.00 20.8 ±0.64* 32.5 ±0.83*

      2.4LTE對(duì)H22小鼠血漿過氧化指標(biāo)的影響LTE高劑量組SOD酶活力明顯升高,而中、高劑量組MDA含量則減少,與模型組比較,差異有顯著性(P<0.05)。見Tab 2。

      2.5LTE對(duì)H22小鼠紅細(xì)胞溶血度的影響中、高劑量組紅細(xì)胞溶血度明顯下降,與模型組比較,差異有顯著性(P<0.05)。見Tab 2。

      Tab 2 Effect of LTE on hemolytic degree and SOD and MDA in serum of H22 mice(±s)

      Tab 2 Effect of LTE on hemolytic degree and SOD and MDA in serum of H22 mice(±s)

      *P<0.05 vs model group

      Group n Dose/mg·kg-1·d-1 hemolytic degree/%Model 9 0.00 28.87 ±3.17 57.98 ±4.16 14.52 ±5.67 SOD/kU·L-1 MDA/μmol·L -1 LTE 9 25.00 35.01 ±5.84 45.22 ±8.81 11.42 ±6.63 8 50.00 42.95 ±7.23 32.39 ±6.16* 7.57 ±3.34*7 100.00 57.13 ±6.38* 24.85 ±3.68* 6.40 ±2.16*

      3 討論

      突變型p53蛋白是腫瘤組織所特有的標(biāo)志蛋白,檢測(cè)該基因蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)情況是反映腫瘤生長(zhǎng)狀況的一個(gè)重要指標(biāo)[5]。MMP-9又稱明膠酶B(gelatinase-B),檢測(cè)腫瘤組織中MMP-9蛋白的表達(dá)情況對(duì)評(píng)價(jià)藥物對(duì)腫瘤的治療效果具有重要意義[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LTE干預(yù)組腫瘤生長(zhǎng)普遍被抑制,同時(shí),其p53和MMP-9蛋白的表達(dá)水平明顯下降。表明LTE可通過下調(diào)p53和MMP-9等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),限制腫瘤組織的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,抑制小鼠H22腫瘤組織生長(zhǎng)。

      大量研究證實(shí),腫瘤患者可通過多種途徑引發(fā)氧化應(yīng)激,而提高SOD、GSH等抗氧化劑的表達(dá)水平及活性,可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。H2O2是活性氧的一種,通常被用于誘導(dǎo)紅細(xì)胞溶血,以檢測(cè)紅細(xì)胞膜抗氧化能力[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,一定劑量的LTE可明顯提高H22荷瘤小鼠血漿中SOD酶活力,降低脂質(zhì)過氧化物MDA含量,減少H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血。表明LTE具有較強(qiáng)的抗氧化活性,可有效阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng),提高機(jī)體抗氧化能力,這可能也是LTE抑制H22腫瘤生長(zhǎng)的另一機(jī)制。

      總之,凹頂藻萜類化合物作為一種海洋天然活性物質(zhì),可有效抑制H22荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng),值得進(jìn)一步開發(fā)利用和深入探索。

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