穿孔膜片鉗方法記錄L型鈣通道及脫氫紫堇堿對其影響的研究

孟紅旭，王 寶，劉建勛

(中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實驗研究中心，北京 100091)

在采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對L型鈣通道電流記錄時，L型鈣通道電流會發(fā)生隨時間的經(jīng)過而逐漸減小的“rundown”現(xiàn)象，對觀察藥物對L型鈣通道效應(yīng)造成很大影響。而穿孔的膜片鉗方法的使用減少了“rundown”現(xiàn)象的發(fā)生。此文比較了全細(xì)胞膜片鉗和穿孔膜片鉗方法記錄L型鈣通道電流隨時間經(jīng)過的變化差異，并觀察了脫氫紫堇堿(dehydrocorydaline，DHC)對L型鈣通道的影響。

1 材料與方法

1.1心室肌細(xì)胞的分離采用急性酶分法獲得單個心室肌細(xì)胞［1］。

1.2膜片鉗技術(shù)通過電極拉制儀(PULL-100，美國)拉制電極，選擇桿狀、表面光滑、紋理清晰的心肌細(xì)胞，利用三維操縱器移動電極貼近目標(biāo)細(xì)胞，并輕壓在細(xì)胞表面，稍加負(fù)壓即可形成1 GΩ水平以上的高阻抗封接，再用較大負(fù)壓吸破細(xì)胞膜，形成普通的全細(xì)胞記錄形式。穿孔膜片鉗技術(shù)需要在電極內(nèi)液中充入兩性霉素B(0.2～0.3 g·L－1，Sigma)，移動電極貼近目標(biāo)細(xì)胞，并輕壓在細(xì)胞表面，稍加負(fù)壓，幾分鐘內(nèi)可見系統(tǒng)阻抗逐漸降低，至100 MΩ左右形成穩(wěn)定穿孔。實驗過程由刺激采集軟件Pulse控制，經(jīng)膜片鉗放大器 (EPC10，德國)，通過模數(shù)轉(zhuǎn)換采集數(shù)據(jù)，存放于計算機硬盤。

1.3L-型鈣通道電流記錄方法將細(xì)胞鉗制在－40 mV使鈉通道和T型鈣通道失活，電極內(nèi)液用CsCl代替KCl阻斷K+電流外流。給予從－40mV至0mV持續(xù)250 ms的除極電壓，可以得到迅速活化緩慢失活的內(nèi)向電流，能夠被鹽酸地爾硫卓(10 μmol·L－1)阻斷［2］，確定為 L 型鈣通道電流。根據(jù)實驗情況分別采用全細(xì)胞膜片鉗和穿孔膜片鉗方法每隔10、15、30 s給予上述除極電壓連續(xù)記錄15 min以上。L型鈣電流峰值幅度取電流活化峰值點與失活后電流軌跡的垂直距離。

1.4藥物和配制液體

1.4.1藥物人參皂苷Re由中國藥品生物制品檢定所購置，批號:1107054-200421;脫氫紫堇堿由中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實驗中心提供;配液所需藥品由英國Alfa Aesar公司購置。

1.4.2配制液體(mmol·L－1)無鈣臺式液:NaCl 140，KCl 5.4，NaH2PO40.33，MgCl21，Glucose 10，Hepes 10(pH 7.4 NaOH);KB液:KOH 70，KCl 40，KH2PO420，Glutamic acid 50，MgCl23，Taurine 20，EGTA 0.5，Hepes 10，Glucose 10(pH 7.4 KOH);細(xì)胞外液:臺式液(無鈣臺式液 +CaCl21.8);電極內(nèi)液:CsCl 140，MgCl22，CaCl21，EGTA 11，MgATP 5，Hepes 10(pH 7.2 CsOH)

1.5數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)采用同一細(xì)胞給藥前后比較，用±s表示。所獲數(shù)據(jù)采用組間t檢驗。

2 結(jié)果

2.1采用全細(xì)胞膜片鉗和穿孔膜片鉗方法記錄L－型鈣通道電流隨時間經(jīng)過的比較普通的全細(xì)胞膜片鉗方法記錄的L型鈣通道電流“rundown”現(xiàn)象非常明顯，電流峰值隨時間經(jīng)過出現(xiàn)明顯衰減，15 min內(nèi)衰減幅度能達(dá)到初始值的(34±23)%(n=10)。Fig 1A、C顯示了一例采用普通的全細(xì)胞膜片鉗方法每隔10 s給予除極刺激電壓連續(xù)記錄15 min L型鈣通道電流隨時間經(jīng)過的變化情況:C圖顯示15 min內(nèi)電流峰值幅度隨時間經(jīng)過逐漸衰減，a，b，c，d 分別是1、6、11、15 min 時間點的電流峰值，而對應(yīng)這些時間點的電流軌跡則在A圖顯示。這例細(xì)胞的電流峰值在15 min時衰減了30%。Fig 1B、D顯示了一例采用穿孔膜片鉗方法的記錄:這例細(xì)胞的電流峰值在15 min時幾乎沒有衰減，a，b，c，d 分別顯示1、6、11、15 min時間點的電流軌跡和峰值。采用穿孔全細(xì)胞膜片鉗方法對10個細(xì)胞的觀察發(fā)現(xiàn):電流峰值在15 min內(nèi)的衰減幅度為(2.7±3.4)%，甚至一些細(xì)胞的電流峰值還略有升高。獲得兩組數(shù)據(jù)經(jīng)組間t檢驗P＜0.01，差異有顯著性。同時我們發(fā)現(xiàn)穿孔膜片鉗方法記錄到的L型鈣通道電流的失活速度明顯快于普通全細(xì)胞的記錄。

2.2采用全細(xì)胞膜片鉗和穿孔膜片鉗方法觀察人參皂苷Re對L型鈣通道電流的抑制效應(yīng)人參皂苷Re是人參的一種有效成分，有報道其對豚鼠心室肌細(xì)胞L型鈣通道電有抑制作用［3］，本研究使用它來觀察全細(xì)胞膜片鉗和穿孔膜片鉗方法在記錄藥物抑制效應(yīng)中的差異。Fig 2A、C顯示一例采用普通全細(xì)胞膜片鉗方法連續(xù)記錄給予人參皂苷Re(100 μmol·L－1)后L型鈣通道電流隨時間經(jīng)過的變化情況:A圖為電流軌跡的變化，C圖為電流峰值幅度的改變。a，b，c分別顯示給藥前、給藥中、洗脫后3種狀態(tài)。由于給藥前后電流峰值抑制處于衰減狀態(tài)，無法判斷人參皂苷Re是否具有抑制效應(yīng)。在記錄的其他5個細(xì)胞中都出現(xiàn)與圖例相同的情況。而采用穿孔全細(xì)胞膜片鉗方法記錄的5個細(xì)胞中，給予人參皂苷Re后電流峰值逐漸被消減，藥物洗脫后被消減的峰值逐漸恢復(fù)，經(jīng)過統(tǒng)計人參皂苷Re(100 μmol·L－1)對 L型鈣通道電流的抑制率為(77.4±6.68)%。Fig 2B、D是一例采用穿孔全細(xì)胞膜片鉗方法連續(xù)記錄的給予人參皂苷Re前后通道電流的變化狀況。a、b、c分別是給藥前、給藥中、洗脫后電流的電流峰值和電流軌跡。

2.3采用穿孔膜片鉗方法觀察脫氫紫堇堿對L型鈣通道的影響脫氫紫堇堿是中藥元胡的一種有效成分，具有抗心肌缺血作用。我們采用穿孔膜片鉗方法記錄了脫氫紫堇堿(10，100 μmol·L－1)對 L型鈣通道電流峰值的影響。Fig 3顯示一例給與脫氫紫堇堿前后通道電流隨時間經(jīng)過的變化狀況，低濃度藥物能夠輕微消減電流峰值，高濃度的藥物對電流峰值的消減非常明顯，藥物洗脫后電流幾乎完全恢復(fù)。a，b，c分別顯示了是給藥前、給藥中電流峰值和電流軌跡。脫氫紫堇堿(10，100 μmol·L－1)對其他細(xì)胞也表現(xiàn)出抑制效應(yīng)，對L-型鈣通道I電流峰值的抑制率分別為(9±7.5)%(n=5)和(28.6±8.5)%(n=5)，兩組數(shù)據(jù)經(jīng)組間t檢驗P＜0.01，差異有顯著性，顯示這種抑制效應(yīng)具有濃度依賴性。

Fig 1 Changes of L-type calcium channel currents curve(over)and current peak(under)over time through recorded by whole cell patch clamp(A，C)and perforated patch clamp method(B，D)

3 討論

由于L鈣通道開閉受細(xì)胞內(nèi)磷酸化的調(diào)節(jié)明顯，因此采用全細(xì)胞方法記錄“rundown”現(xiàn)象比較明顯。本研究結(jié)果顯示這種電流衰減對藥物作用的觀察產(chǎn)生很大影響。采用穿孔的膜片鉗技術(shù)能夠?qū)⑩}電流衰減率從30%減少到10%以內(nèi)，并能夠穩(wěn)定記錄對中藥有效成分人參皂苷Re抑制效應(yīng)，表明穿孔膜片鉗方法在記錄L型鈣通道電流記錄方面具穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，較全細(xì)胞膜片鉗方法更適合對藥物作用進行觀察。一些具有抗心肌缺血的中藥有效成分具有鈣通道抑制劑的作用［4－6］，這些有效成分對鈣通道作用途徑似乎與臨床常用的鈣拮抗劑直接作用于鈣通道蛋白不同，而是通過一些細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮抑制效應(yīng)［1，7］。穿孔膜片鉗技術(shù)是在保持心肌細(xì)胞內(nèi)容物保持相對穩(wěn)定的條件下實施，因此更適合研究中藥有效成分對鈣通道的影響。

Fig 2 Effect of ginsenoside Re on L-type calcium channel currents recorded by whole cell patch clamp(A，C)and perforated patch clamp method(B，D)

Fig 3 Effect of Dehydrocorydaline(DHC 10，100 μmol·L －1)on L-type calcium channel currents recorded by perforated patch clamp method

中藥元胡中一種生物堿脫氫紫堇堿具有抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的作用，并且在正常氧和低氧條件下能夠阻止心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載［8－9］，本研究結(jié)果顯示脫氫紫堇堿能夠濃度依賴性的抑制L型鈣通道提示脫氫紫堇堿抗心肌缺血作用的機制可能是通過抑制L型鈣通道的開放減少鈣內(nèi)流而抑制鈣超載，減輕心肌缺氧/復(fù)氧損傷。

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