丹參酮ⅡA對低分化鼻咽癌細胞氯通道的激活作用

李 媛，劉善文，李華榮，馬文波，潘廷才，朱林燕，葉文才，王立偉，陳麗新

(暨南大學1.醫(yī)學院藥理學系、2.醫(yī)學院生理學系、3.藥學院，廣東廣州 510632)

丹參是臨床常用中藥，廣泛應用于治療心血管疾病，具有擴張血管、降壓、抗血栓的功能，對治療冠心病、心絞痛、心律過速有明顯療效［1］。丹參酮ⅡA(TanⅡA)是丹參的主要提取物之一。近年來，人們發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA對多種腫瘤細胞具有抑制增殖，促進凋亡，誘導分化的作用［2］。我們前期的研究表明［3-4］，氯通道在細胞增殖、細胞周期中發(fā)揮重要作用，與順鉑誘導的低分化鼻咽癌細胞凋亡相關。本實驗擬采用全細胞膜片鉗技術直接觀察丹參酮ⅡA對低分化鼻咽癌細胞氯離子通道的激活作用，并分析丹參酮ⅡA誘導的電流特征，為進一步闡明丹參酮ⅡA誘導細胞凋亡的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)低分化鼻咽癌細胞CNE-2Z用含10% 新生牛血清(Gibco，美國)、1 × 105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的 RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco，美國)在 37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中，按常規(guī)方法傳代。實驗前消化細胞，將細胞懸液接種在直徑22 mm的圓形玻片上，放入培養(yǎng)箱，待細胞貼壁1 h后進行實驗。

1.2主要試劑及來源丹參酮ⅡA購自深圳美荷生物科技有限公司，用二甲基亞砜(DMSO)配制成10 mmol·L-1儲存液，使用前用細胞灌流液稀釋至1 nmol·L-1;氯通道阻斷劑 5-nitro-2-(3-henylpropylamino)benzoic acid(NPPB)，用 DMSO配制成100 mmol·L-1儲存液，使用前稀釋至 100 μmol·L-1。除特殊說明外，所有的試劑和藥品均購于美國Sigma公司。

1.3細胞外灌流液等張灌流液滲透壓為300 mOsm·L-1，含(mmol·L-1):70 NaCl、0.5 MgCl2、2 CaCl2、10 HEPES和140 D-甘露醇。高張灌流液滲透壓為440 mOsm·L-1，除增加140 mmol·L-1D-甘露醇外，其它成份和濃度與等張灌流液相同。灌流液用Tris-base液調pH值至7.40，用冰點滲透壓計(Osmomat030;Gonotec，Germany)檢測滲透壓。

1.4電極內液電極內液含(mmol·L-1):70N-methyl-D-glucamine chloride(NMDG-Cl)、1.2 MgCl2、10 HEPES、1 EGTA、140 D-甘露醇和 2 ATP，用 Trisbase調pH值至7.25，用孔徑0.22 μm的無菌過濾器過濾。滲透壓為300 mOsm·L-1。

1.5全細胞膜片鉗記錄用EPC-7膜片鉗放大器(List Electronic，Germany)記錄單個細胞的全細胞電流。電流和電壓信號用 CED1401(Cambrige，UK)數(shù)字化(采樣頻率 3 kHz)，實驗數(shù)據(jù)用 EPC(CED，Cambridge，UK)軟件分析。在電壓鉗制模式下，細胞被鉗制在0、±40、±80 mV，每個鉗制脈沖波間隔4 s，持續(xù)200 ms，不斷反復循環(huán)。實驗在室溫(20℃ ～24℃)下進行。

貼有細胞的玻片安放在灌流槽中，全細胞記錄形成后，記錄穩(wěn)定的背景電流，隨后用丹參酮ⅡA激活氯電流，記錄激活電流的潛伏期、達峰時間、電流密度等。電流達到峰值并平穩(wěn)后，加入 NPPB，待電流達到最小值并平穩(wěn)后終止記錄。計算NPPB對丹參酮ⅡA激活電流的抑制率。抑制率的計算公式為:抑制率/% =〔(CTan-CIso)-(CBlockers-CIso)〕/(CTan-CIso)×100%，其中CIso是等張條件下的電流值，CTan是丹參酮ⅡA激活的電流最大值，CBlockers是加入阻斷劑后的最大效應時的電流值。

在觀察丹參酮ⅡA激活氯通道的容積敏感性實驗中，當?shù)⑼駻激活細胞電流達到峰值并穩(wěn)定后，換為含相同濃度丹參酮 ⅡA的高滲灌流液，觀察滲透性細胞容積縮小對丹參酮ⅡA激活氯電流的影響。

1.6統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)經SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，用方差分析(Anova)進行顯著性檢驗，數(shù)據(jù)用±s表示，每次實驗均重復3次以上。

2 結果

2.1丹參酮ⅡA激活CNE-2Z細胞氯通道如Fig 1A所示，細胞背景電流較小而且穩(wěn)定。在-80 mV電壓鉗制下，氯離子從細胞內流向細胞外，形成內向電流，平均電流密度為(-5.6±0.9)pA/pF;在+80 mV電壓鉗制下，氯離子從細胞外流向細胞內，形成外向電流，平均電流密度為(4.8±0.6)pA/pF。隨后用含有1 nmol·L-1丹參酮ⅡA的等張灌流液連續(xù)灌流時，可激活一個電流，激活潛伏期為(67.9±18.2)s，隨藥物作用時間延長，電流逐漸增大，約(1051.5±215.3)s達到峰值進入平穩(wěn)期。如Fig 1B所示，在±120 mV電壓持續(xù) 300 ms鉗制條件下，該電流沒有明顯電壓依從性失活和時間依從性失活。Fig 1C顯示了丹參酮ⅡA激活電流的全程圖。在 -80 mV電壓鉗制下，內向電流峰值的電流密度為(-54.2±13.7)pA/pF，+80 mV電壓鉗制下外向電流的電流密度為(71.0±16.1)pA/pF，外向電流較之內向電流大，表現(xiàn)了較明顯外向優(yōu)勢(n=8，P=0.010)，該電流的翻轉電位為(-5.9±0.2)mV(n=8)，見 Fig 1D。

Fig 1 TanshinoneⅡA-induced whole-cell currents in CNE-2Z cells

2.2高張液對丹參酮ⅡA激活氯電流的抑制作用在細胞外灌流含1 nmol·L-1丹參酮ⅡA的等張灌流液，激活電流并達到峰值穩(wěn)定3min后，換用含相同濃度的丹參酮ⅡA的高張液(Hyper)灌流，如Fig 2所示，440 mOsm·L-1高張灌流液可以迅速完全抑制丹參酮ⅡA激活的氯電流。Fig 2A和2B分別顯示了丹參酮ⅡA激活的氯電流和高張液的抑制作用的瞬時圖，F(xiàn)ig 2C顯示了高張液抑制作用的全過程。在-80 mV電壓鉗制下，高張液使丹參酮ⅡA激活的內向電流從(-54.2±13.7)pA/pF下降到(-7.1±2.3)pA/pF，抑制率為(97.0±3.2)%(n=5，P=0.005)，+80 mV 電壓鉗制下，外向電流從(71.0±16.1)pA/pF下降到(7.2±3.5)pA/pF，抑制率為(96.5±4.2)%(P=0.004)。高張液對內外向電流的抑制率差異沒有顯著性(P=0.618)，見Fig 2D。丹參酮ⅡA激活的氯電流被高張液抑制，表明該電流具有容積敏感性。

2.3氯通道阻斷劑對丹參酮ⅡA激活氯電流的抑制作用NPPB是常用的氯通道阻斷劑，本實驗觀察了NPPB對丹參酮ⅡA激活氯電流的影響。Fig 3A和3B分別 顯示了100 μmol·L-1NPPB抑制丹參酮ⅡA激活的電流的瞬時圖和全過程。電壓鉗制在 ±80 mV時，等張灌流液組(Iso)、丹參酮ⅡA組(TanⅡA)、丹參酮ⅡA+氯通道阻斷劑組(TanⅡA+NPPB)組的電流密度見Fig 3C。結果表明，NPPB可抑制丹參酮ⅡA激活的氯電流，-80 mV電壓鉗制下，內向電流從(-54.2±13.7)pA/pF下降到(-14.1±4.3)pA/pF，抑制率為(75.8±11.3)%(n=5，P=0.031)，+80 mV電壓鉗制下，外向電流從(71.0±16.1)pA/pF下降到(21.1±7.9)pA/pF，抑制率為(76.8±10.3)%(P=0.017)，NPPB對內外向電流的抑制率差異沒有顯著性(P=0.668)。

Fig 2 Inhibition of tanshinoneⅡA-induced chloride currents by hypertonic solutions

Fig 3 Inhibition of tanshinoneⅡA-induced chloride currents by chloride channel blocker NPPB

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可通過降低VEGF［5］、突變型 p53 蛋白和 Bcl-2 蛋白的表達［6］，上調 Fas、Caspase-3 mRNA［7］，抑制原癌基因 cmyc［8］和 BCRP/ABCG2 基因［9］的表達等發(fā)揮抗癌作用。

研究表明，氯通道與細胞容積調節(jié)［10-11］、細胞增殖和周期［3］、細胞遷移［12］及細胞凋亡［3，13-14］密切相關。我們前期的研究表明，氯通道參與凋亡性細胞容積減小，凋亡誘導劑順鉑和過氧化氫在短時間內激活氯通道，引起細胞內氯離子和鉀離子的外流，同時伴隨水的外流而導致細胞容積減小，誘導鼻咽癌細胞凋亡，NPPB抑制順鉑和過氧化氫誘導的凋亡，提示氯通道參與了凋亡的發(fā)生［4，13］。丹參酮ⅡA誘導凋亡的作用是否與氯通道相關，鮮見文獻報道。

本研究用膜片鉗方法，直接觀察丹參酮ⅡA對氯離子通道的激活作用，實驗結果表明，細胞外灌流低濃度丹參酮ⅡA可激活一個具有明顯外向優(yōu)勢的電流，該電流在不同鉗制電壓下其電流方向和 Cl-運動方向一致，電流的翻轉電位接近于 Cl-的平衡電位(-0.9 mV)，推測該電流為氯電流。進一步實驗證實，氯通道阻斷劑NPPB可抑制該電流，因此這是一個由氯通道介導的氯電流，本結果為丹參酮ⅡA激活氯通道提供了直接的實驗證據(jù)，提示丹參酮ⅡA可能通過某些信號轉導途徑，激活細胞膜氯離子通道，誘發(fā)細胞凋亡性容積減小，誘導細胞凋亡而發(fā)揮其抗癌作用。

丹參酮ⅡA激活的氯電流具有明顯的外向優(yōu)勢，無明顯的時間依從性失活和電壓依從性失活，可以被高張灌流液完全抑制，被NPPB抑制，且對內外向電流抑制作用差異無顯著性，這些特征與我們以前報道的鼻咽癌細胞容積敏感性氯通道［3］的特征相似，但容積敏感性氯通道是在細胞外低張環(huán)境或細胞內高張環(huán)境引起細胞腫脹時而激活，而本實驗中，氯通道是在等張環(huán)境、非細胞腫脹條件下而被丹參酮ⅡA激活，即激活氯通道的條件不同，提示這兩種通道的激活途徑不一樣。綜上所述，丹參酮ⅡA可以激活低分化鼻咽癌細胞氯通道，但其具體的激活途徑，以及激活氯通道后對細胞功能的影響等有待探討。

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