中獸藥散劑中非法添加利巴韋林的檢測(cè)方法研究

崔成富，陳創(chuàng)華，林海丹，黃寶珠，鄧國(guó)東

(廣東省獸藥與飼料監(jiān)察總所，廣州 510230)

利巴韋林(Ribavirin)，又稱病毒唑或三氮唑核苷，為廣譜抗病毒藥物，對(duì)多種病毒有抑制作用。該藥曾在畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)廣泛應(yīng)用，用于預(yù)防和治療病毒性疾病。但其作為人用抗病毒藥移植獸用，缺乏科學(xué)規(guī)范、安全有效實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù);用于動(dòng)物病毒性疫病不但給動(dòng)物疫病控制帶來(lái)不良后果，而且影響國(guó)家動(dòng)物疫病防控政策的實(shí)施［1］;不規(guī)范使用可導(dǎo)致動(dòng)物中毒［2］，在動(dòng)物性食品中的殘留對(duì)人體具有潛在危害，可引起變態(tài)反應(yīng)和造血系統(tǒng)功能障礙［3］，因此農(nóng)業(yè)部公告第560號(hào)已規(guī)定取消其在動(dòng)物疾病預(yù)防控制上的使用。但目前仍有部分獸藥生產(chǎn)企業(yè)為了提高某些中獸藥散劑的所謂抗病毒療效，在中獸藥散劑中非法添加了利巴韋林，致使飼養(yǎng)戶在不知情的情況下使用了這些產(chǎn)品，從而容易導(dǎo)致藥物在動(dòng)物源性食品中殘留，嚴(yán)重影響動(dòng)物產(chǎn)品的質(zhì)量安全，進(jìn)而危害人體健康。目前我國(guó)尚無(wú)中獸藥散劑中利巴韋林的檢測(cè)方法，對(duì)此類違法行為缺乏有效的監(jiān)測(cè)手段。本研究在對(duì)中獸藥散劑中利巴韋林顯微特征進(jìn)行觀察的基礎(chǔ)上，建立一種簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確的高效液相色譜法，對(duì)中獸藥散劑中非法添加的利巴韋林進(jìn)行定性定量測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 卡爾·蔡司顯微鏡:Standard25ICS;高效液相色譜儀:Aglient 1200型，配二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó) Aglient公司;電子天平:CPA225D型，德國(guó) Sartorius公司;制超純水機(jī):F3PN33491型，美國(guó)Millipore公司。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 對(duì)照品 利巴韋林對(duì)照品，批號(hào)629－200202，含量100.0%，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.2.2 供試品

1.2.2.1 陰性對(duì)照散劑 清瘟敗毒散:廣州綠州生物技術(shù)有限公司;蒼術(shù)香連散:廣州市和生堂動(dòng)物藥業(yè)有限公司。以上兩種中獸藥散劑經(jīng)檢測(cè)均不含利巴韋林。

1.2.2.2 陽(yáng)性添加散劑 分別按照0.05%、0.1%和0.2%的比例在陰性對(duì)照散劑中添加利巴韋林對(duì)照品，混勻。

1.2.2.3 試劑 甘油，超純水。

1.2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制(2.5 mg/mL)精密稱取利巴韋林對(duì)照品125 mg于50 mL量瓶中，用超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為2.5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 顯微檢查法 取利巴韋林對(duì)照品、兩種中獸藥散劑的陰性樣品以及陽(yáng)性添加樣品少許，置載玻片上，滴加甘油2～3滴，攪勻，封片，置顯微鏡下觀察。利巴韋林的顯微特征為無(wú)色或淡黃綠色結(jié)晶，呈棒形或一端或兩端呈梭形，長(zhǎng)短不一，表面有縱裂紋或裂縫紋。

1.3.2 高效液相色譜法

1.3.2.1 色譜條件 色譜柱為 Ultimate XB－C18(150 mm ×4.6 mm，5μm)，流動(dòng)相為超純水，檢測(cè)波長(zhǎng)207 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫25℃。

1.3.2.2 樣品測(cè)定 精密稱取中獸藥散劑約2.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL超純水搖勻，超聲15 min，靜置，濾過(guò)，取續(xù)濾液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用超純水分別稀釋為 1、5、25、50、100、150 μg/mL濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2 結(jié)果

2.1 顯微圖 按1.3.1項(xiàng)方法，對(duì)利巴韋林對(duì)照品、兩種中獸藥散劑的陰性樣品以及陽(yáng)性添加樣品進(jìn)行觀察。顯微圖譜如圖1所示。

圖1 利巴韋林對(duì)照品顯微圖譜

2.2 色譜圖 在1.3.2.1項(xiàng)的色譜條件下，對(duì)利巴韋林對(duì)照品溶液、兩種中獸藥散劑的陰性樣品溶液以及陽(yáng)性添加樣品溶液采用峰面積法進(jìn)行測(cè)定。利巴韋林與樣品中其他成分能夠很好地分離，利巴韋林的保留時(shí)間約為5.9 min，其峰形良好。利巴韋林對(duì)照品溶液光譜及色譜圖、兩種中獸藥散劑的陰性樣品溶液及陽(yáng)性樣品溶液色譜圖如圖2～圖4所示。

圖2 利巴韋林對(duì)照品溶液(50 μg/mL)光譜圖和色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以利巴韋林色譜峰面積Y與對(duì)照品溶液濃度C(μg/mL)作線性回歸，得到線性方程為 Y=26.058C+0.5228(r=1.00000)，結(jié)果表明利巴韋林在1～150 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn) 取每1 mL含50 μg的利巴韋林對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，記錄峰面積，計(jì)算變異系數(shù)RSD，結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明6次重復(fù)進(jìn)樣的RSD為0.02%，外標(biāo)法測(cè)定利巴韋林具有良好的重現(xiàn)性。

表1 連續(xù)進(jìn)樣精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.5 最低檢測(cè)限 在上述色譜條件下，將利巴韋林對(duì)照品溶液加入陰性散劑中，并逐步減少對(duì)照品溶液的量，按1.3.2.2制備進(jìn)樣，以信噪比的3倍為最低檢出限，測(cè)得蒼術(shù)香連散的最低檢出濃度為0.1 μg/mL，最低檢測(cè)限為 2 mg/kg;清瘟敗毒散的最低檢出濃度為0.05 μg/mL，最低檢測(cè)限為 1 mg/kg。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取已添加利巴韋林的蒼術(shù)香連散與清瘟敗毒散(0.1%添加量)各6份，按1.3.2.2項(xiàng)方法測(cè)定，計(jì)算利巴韋林的含量，考察方法重復(fù)性。結(jié)果表明方法重復(fù)性良好，其RSD分別為 1.04%和 1.32%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取上述2.6項(xiàng)下制備的供試液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積。結(jié)果表明樣品溶液在24 h穩(wěn)定性良好。

2.8 回收率 取上述兩種中獸藥的散劑按表2添加不同濃度的利巴韋林制成陽(yáng)性散劑，按照1.3.2.2項(xiàng)方法測(cè)定，計(jì)算回收率及其變異系數(shù)。每個(gè)散劑的每個(gè)添加濃度進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定。結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，兩種中獸藥散劑的添加平均回收率在91.74% ～98.50%之間，變異系數(shù)在0.08% ～0.58%之間?？紤]到中藥散劑成分的復(fù)雜性，測(cè)試數(shù)據(jù)表明該方法回收率較好，準(zhǔn)確度高。

表2 中獸藥散劑中利巴韋林添加回收率及其變異系數(shù)

3 討論

3.1 中獸藥散劑種類的選擇 清瘟敗毒散具有瀉火解毒、涼血功效，主治熱毒發(fā)斑、高熱神昏。蒼術(shù)香連散具有清熱燥濕的功效，主治腸黃、下痢、濕熱泄瀉。這兩種散劑均有一定的預(yù)防和治療腸道感染的作用。利巴韋林因?qū)NA和RNA病毒均有效，對(duì)腸病毒等引起的感染有顯著療效，故在畜禽養(yǎng)殖中極有可能被非法添加到上述兩種中獸藥散劑中，用于治療和預(yù)防腸道感染。因此本研究選取了清瘟敗毒散和蒼術(shù)香連散作為檢測(cè)的對(duì)象。

3.2 快速篩選方法的建立 因液相法相對(duì)檢測(cè)周期長(zhǎng)，成本高，本方法首先使用顯微檢查方法對(duì)樣本進(jìn)行快速篩選。顯微檢查中若檢出如圖1中所示結(jié)晶物質(zhì)，則表明可能非法添加利巴韋林;對(duì)陽(yáng)性樣品再利用高效液相色譜法，通過(guò)與對(duì)照品色譜圖保留時(shí)間、光譜圖的比對(duì)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種中獸藥散劑中的利巴韋林進(jìn)行大批量的快速定性判定和定量測(cè)定。

3.3 顯微試液的選擇 對(duì)利巴韋林特征進(jìn)行顯微觀察時(shí)，分別用水合氯醛、甘油醋酸、甘油乙醇和甘油試液進(jìn)行了試驗(yàn)。結(jié)果表明用水合氯醛、甘油醋酸和甘油乙醇試液時(shí)，因利巴韋林溶于水、微溶于乙醇，在顯微鏡下觀察不到利巴韋林的顯微特征;而用甘油試液則可以很好地觀察到其顯微特征，選擇甘油試液可以在顯微鏡下觀察到中獸藥散劑中添加0.05%的利巴韋林的顯微特征。所以最終以甘油作為利巴韋林顯微觀察的試劑。

3.4 提取溶劑、流動(dòng)相的選擇 考慮到中獸藥散劑中多種成分溶于有機(jī)溶劑，可能干擾利巴韋林的檢測(cè)，而利巴韋林溶于水，故排除用有機(jī)溶劑作提取液，而采用超純水作為提取溶劑［3］。通過(guò)調(diào)節(jié)超純水的pH值(pH 6～8)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)pH值對(duì)利巴韋林的出峰時(shí)間和峰形無(wú)明顯影響，故用普通超純水作流動(dòng)相。

3.5 色譜柱的選擇 在用超純水作流動(dòng)相［3］時(shí)，曾用Zorbax Eclipse XDB－C18(Aglient)為色譜柱，發(fā)現(xiàn)出峰時(shí)間比較短，與雜峰分離度不佳，且出峰保留時(shí)間不一致，重復(fù)性不好。改用親水性色譜柱Ultimate XB－C18(Welch Materials)后，與雜峰分離較好，特別是保留時(shí)間重復(fù)性改善，故使用親水性色譜柱Ultimate XB－C18(Welch Materials)來(lái)測(cè)定利巴韋林。

3.6 添加回收率試驗(yàn)濃度的選擇 根據(jù)兩種中藥散劑在預(yù)防和治療畜禽的用量及臨床中利巴韋林的預(yù)防和治療用量，選擇在中獸藥散劑中分別添加0.05%、0.1%和 0.2%利巴韋林作為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定其回收率及變異系數(shù)，可以更符合非法添加利巴韋林的實(shí)際情況。

4 結(jié)論

本文建立的顯微檢查初篩、再用高效液相色譜進(jìn)行定性及定量的分析方法可快速、準(zhǔn)確地鑒定和測(cè)定清瘟敗毒散和蒼術(shù)香連散兩種中獸藥散劑中違法添加的利巴韋林，對(duì)更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量具有一定的實(shí)用價(jià)值。

［1］楊春蓮.一起豬利巴韋林中毒的診治［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010，5:94.

［2］張 俊，閆 煒，何振鳳，等.利巴韋林不良反應(yīng)綜述［J］.臨床藥物治療雜志，2004，1:61 －62.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典二○○○年版(二部)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2000:302.