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    灰黃霉素在家兔組織中的分布及殘留消除規(guī)律研究

    2011-11-14 08:02:36高淑霞姜文學(xué)楊麗萍
    中國(guó)獸藥雜志 2011年9期
    關(guān)鍵詞:真菌病離心管家兔

    高淑霞,姜文學(xué),楊麗萍

    (山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,濟(jì)南 250100)

    灰黃霉素(Griseofulvin)是灰黃霉素青霉菌的代謝產(chǎn)物,其化學(xué)名稱為6’-甲基-2’,4,6-三甲氧基-7-氯-螺[苯并呋喃-2(3H),1’-[2]環(huán)己烯]-3,4-二酮?;尹S霉素是一種抗真菌抗生素,主要用于治療皮膚真菌病,對(duì)毛發(fā)癬菌、小孢子菌、表皮癬菌等淺部真菌有良好抗菌作用。報(bào)道表明,灰黃霉素用于預(yù)防和治療家兔皮膚真菌病有一定效果[1]。

    據(jù)報(bào)道有人服用灰黃霉素產(chǎn)生毒副作用的病例。胡建佳等[2]報(bào)道了應(yīng)用大劑量灰黃霉素后發(fā)生的6例惡性腫瘤,患者都是因?yàn)橹委煱_病而長(zhǎng)時(shí)間服用大劑量的灰黃霉素,而且無其他致癌因素可追溯。Rosa F W等[3]報(bào)道,部分在妊娠頭3個(gè)月服用灰黃霉素的孕婦分娩出有缺陷的胎兒。張孟霞[4]報(bào)道了一例由于長(zhǎng)期大量服用灰黃霉素而誘發(fā)的遲發(fā)性皮膚卟啉癥。

    目前動(dòng)物性食品安全備受關(guān)注?;尹S霉素在家兔生產(chǎn)中時(shí)有應(yīng)用,但未見家兔服用灰黃霉素后的組織分布及殘留情況相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本文的目的是研究家兔服用灰黃霉素后的組織分布及殘留情況,為灰黃霉素用于治療家兔真菌病的安全性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要儀器設(shè)備 Agilent 1200系列液相色譜系統(tǒng);G1329A柱溫箱、G1311A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1322A泵;Agilent 6410三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀;XW-80A漩渦混合儀;Milli-Q超純水系統(tǒng);TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī);METTLER AB265-S電子天平;H1850臺(tái)式高速冷凍離心機(jī);海爾DW-86L386超低溫冰箱。

    1.2 主要試劑 灰黃霉素供試品(武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司,批號(hào)091147,含量≥95%);灰黃霉素對(duì)照品(AlfaAesar,批號(hào)G8629A,含量97%);鹽酸普萘洛爾內(nèi)標(biāo)物(AlfaAesar,批號(hào)H26645,含量99%);甲醇、乙腈、乙酸均為色譜純;二氯甲烷為分析純。

    1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

    1.3.1 灰黃霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密稱取灰黃霉素(97%)5.12 mg,置于10 mL容量瓶中,加入甲醇溶解后,定容,搖勻,配成濃度為497 μg/mL的灰黃霉素儲(chǔ)備液I。使用時(shí),取儲(chǔ)備液I用甲醇逐級(jí)稀釋為2490、1030、651.25、518.7、259.4、129.7、32.4、10.8 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

    1.3.2 鹽酸普萘洛爾內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密稱取鹽酸普萘洛爾(99%)3.93 mg,置于10 mL容量瓶中,加入甲醇溶解后,定容,搖勻,配成濃度為389 μg/mL的鹽酸普萘洛爾儲(chǔ)備液II。使用時(shí),取儲(chǔ)備液II用甲醇稀釋為116.7 ng/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

    1.4 液相色譜條件 流動(dòng)相為乙腈 ∶水(0.1%乙酸)=65∶35(V∶V);流速 0.4 mL/min;色譜柱:ZORBAX SB-C18預(yù)柱(4.6 mm ×12.5 mm,5 μm),ZORBAX RX-C18色譜柱(2.1 mm × 150 mm,5 μm);柱溫 30℃;進(jìn)樣量 2 μL;采樣時(shí)間 3 min。

    1.5 質(zhì)譜條件 采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描模式進(jìn)行分析檢測(cè)。Agilent 6410串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀,配置了ESI離子源。在ESI(+)模式下,采集數(shù)據(jù)。設(shè)定質(zhì)譜參數(shù)如下:Capillary 4000 V,Drying Gas 10.0 L/min。Neb Press 40.0 psi。Gas Temp 350 ℃,F(xiàn)ragmentor 135,Skimmer 15,Oct DC1(Skim2)45 V,0ct RF 500 V,碰撞氣為氦氣,Q1 和Q3的分辨率均為單位質(zhì)量分辨。MRM模式下灰黃霉素與鹽酸普萘洛爾的定量分析離子對(duì)參數(shù)分別為353.0→165和260→116,碰撞能量均為20 V。

    1.6 組織中灰黃霉素提取方法 稱取一定量的肌肉、腎臟、肝臟、皮膚和腦組織樣品,研磨后凍存于-50℃冰箱中;檢測(cè)時(shí)室溫條件下解凍后,加入116.7 ng/mL的鹽酸普萘洛爾10 μL,再加入5 mL二氯甲烷,快速渦旋提取約1min,樣品于3 000 r/min離心10 min后,取4 mL 下層有機(jī)相0.22 μm針頭式過濾器過濾于10 mL離心管中,氮?dú)獯蹈珊?00 μL甲醇渦旋復(fù)溶后(腦組織氮?dú)獯蹈珊蠹尤? mL甲醇渦旋復(fù)溶后,液體轉(zhuǎn)移至1.5 mL塑料離心管中,12 000 r/min離心10 min后,轉(zhuǎn)移至另一離心管中,氮?dú)獯蹈珊?,加?00 μL甲醇渦旋復(fù)溶),液體轉(zhuǎn)移至1.5 mL塑料離心管中,12 000 r/min離心10 min后,移入棕色瓶中,進(jìn)樣分析。

    1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取空白組織勻漿,分別加入甲醇和不同濃度的灰黃霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液,使組織液中的藥物濃度為 0、1.08、3.24、12.97、25.94、51.87、65.125、103、249 ng/mL,再分別加入 116.7 ng/mL的鹽酸普萘洛爾10 μL和5 mL二氯甲烷,按1.6項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣分析。以分析儀響應(yīng)峰面積(Y)對(duì)灰黃霉素濃度(X)做線性回歸。

    1.8 定量限的測(cè)定 取空白組織勻漿,分別加入各低濃度灰黃霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液,再分別加入116.7 ng/mL的鹽酸普萘洛爾10 μL和5 mL二氯甲烷,按1.6項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣分析。以最低測(cè)得濃度計(jì)算,在信噪比(S/N)為10時(shí),定為定量限。

    1.9 回收率的測(cè)定和精密度試驗(yàn) 各空白組織中分別添加低、中、高三個(gè)藥物濃度,每一濃度5個(gè)平行樣品,于當(dāng)日和連續(xù)3 d測(cè)定,計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。以測(cè)得樣本的峰面積與相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積對(duì)比,計(jì)算方法回收率。

    1.10 實(shí)驗(yàn)方法 選用42只體重2 kg左右、健康的新西蘭白兔,飼料中加入灰黃霉素(800 g/1 000 kg)進(jìn)行飼喂,自由采食、飲水,連續(xù)飼喂14 d。同時(shí)選用6只新西蘭白兔飼喂常規(guī)飼料,作為空白對(duì)照。分別于停藥后第1、3、5、7、9、14、21 天,隨機(jī)宰殺6只,取肌肉、肝臟、腎、腦和皮膚組織樣品,所取樣本不進(jìn)行任何洗滌或處理,隨即對(duì)各組織分別包裝、貼簽、編號(hào),-20℃以下條件保存待分析。并于停藥后第1天同時(shí)取空白對(duì)照組織樣品。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 檢測(cè)方法的有效性 肌肉、腎和肝組織中的灰黃霉素在1.08~249 ng/mL濃度范圍內(nèi),腦、皮膚組織在1.08~51.87 ng/mL濃度范圍內(nèi),儀器響應(yīng)峰面積與濃度呈線性相關(guān),相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99。各組織的定量限均為1.08 ng/mL。各組織的藥物添加回收率為81% ~94%,日內(nèi)變異系數(shù)為4.23% ~12.4%,日間變異系數(shù)為 4.46% ~14.01%。該方法的添加回收率和變異系數(shù)符合生物樣品中的藥物檢測(cè)要求[5],可用于家兔組織中灰黃霉素的檢測(cè)。

    2.2 檢測(cè)結(jié)果

    2.2.1 灰黃霉素在家兔組織中的分布及殘留濃度連續(xù)用藥14 d后,停藥第1天進(jìn)行屠宰、取樣、檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示,除腦組織外,灰黃霉素在各組織中均有分布,肝組織中的濃度最高,為134.61 μg/kg;腎組織濃度較高,為 54.09 μg/kg;腦組織濃度最低,其檢測(cè)值低于定量限?;尹S霉素在家兔組織中的分布及殘留濃度如表1所示。

    表1 不同停藥期灰黃霉素在家兔組織中的分布及殘留濃度(μg/kg)

    2.2.2 灰黃霉素在家兔組織中的消除規(guī)律 結(jié)果表明,停止飼喂添加藥物飼料后,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),灰黃霉素在肌肉、肝、腎和皮膚組織中的濃度逐漸下降,且在肝中的消除最快(圖1)。停藥21 d后,肝、腎組織中仍可檢測(cè)到灰黃霉素殘留,灰黃霉素在腎組織中濃度為3.39 μg/kg,在肝組織中濃度為12.36 μg/kg,其他組織未檢出。

    圖1 灰黃霉素在兔各組織中的殘留消除曲線

    3 小結(jié)

    連續(xù)用藥14 d后,灰黃霉素在家兔組織中的分布情況為肝>腎>肌肉>皮膚>腦組織;停藥后,灰黃霉素在各組織中的濃度均呈下降趨勢(shì)(腦中未檢出),且在肝中的消除最快;停藥21 d后,肝、腎組織中仍可檢測(cè)到灰黃霉素殘留。

    在家兔生產(chǎn)中,少數(shù)養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)采用灰黃霉素對(duì)家兔皮膚真菌病進(jìn)行治療。一方面,灰黃霉素不能隨意作為獸藥使用;另一方面,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道灰黃霉素有毒副作用,用于食品動(dòng)物后,產(chǎn)品中的殘留對(duì)人體的危害尚未知。因此,在目前的家兔生產(chǎn)中應(yīng)慎用灰黃霉素。

    [1]王耀先.灰黃霉素片治兔體表真菌病效果好[J].中國(guó)養(yǎng)兔雜志,2004,6:34-35.

    [2]胡建佳,朱永福,張中一.應(yīng)用大劑量灰黃霉素后發(fā)生惡性腫瘤6 例報(bào)告[J].癌癥,1986,1:115-116.

    [3]Rosa F W,Hernandez C,Carlo W A.Griseofulvin Teratology,Including Two Thoracopagus Conjoined Twins[J].Lancet,1987,1(8525):171.

    [4]張孟霞.灰黃霉素誘發(fā)遲發(fā)性皮膚卟啉癥一例報(bào)告[J].湖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1984,9(3):315.

    [5] 操繼躍,盧笑叢.獸醫(yī)藥物動(dòng)力學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2005:176-217.

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