復(fù)方桂術(shù)膠囊對(duì)小鼠Lewis肺癌的抑制及TNF-α和IFN-γ的影響

張樹(shù)涌， 張 歌， 曹 勇， 張 娜， 宋 璟， 李可馨

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，廣東廣州 510632)

復(fù)方桂術(shù)膠囊是由黃芪、肉桂、補(bǔ)骨脂、莪術(shù)、仙鶴草、半枝蓮、瓜蔞皮組成的中藥復(fù)方制劑，具有補(bǔ)腎益肺、化瘀解毒作用，臨床觀(guān)察表明，復(fù)方桂術(shù)膠囊方藥對(duì)中晚期肺癌和肺癌化療期及化療后康復(fù)期，具有改善臨床癥狀，減輕化療毒副作用，提高生活質(zhì)量，降低復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)肺癌患者生存期作用。復(fù)方桂術(shù)膠囊的前期研究表明其方藥對(duì)多種腫瘤均具有抑制作用［1-2］，為了進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)肺癌的抑瘤作用，探討復(fù)方桂術(shù)膠囊抗腫瘤作用機(jī)理，以小鼠Lewis肺癌為模型，研究復(fù)方桂術(shù)膠囊對(duì)荷瘤小鼠的抑瘤作用，并觀(guān)察對(duì)其血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-γ(IFN-γ)的影響，從而為臨床運(yùn)用復(fù)方桂術(shù)膠囊治療肺癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物 復(fù)方桂術(shù)膠囊:由暨南大學(xué)藥學(xué)院中藥制劑室提供，由黃芪、肉桂、補(bǔ)骨脂、莪術(shù)、仙鶴草、半枝蓮、瓜蔞皮組成，每粒裝 0.5 g，相當(dāng)于生藥 2 g，批號(hào)，091014。

1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6J小鼠:6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK(粵)2009-0011。

1.3 瘤株 小鼠Lewis肺癌:購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.4 試劑 TNF-α及IFN-γ ELISA試劑盒:購(gòu)于武漢博士德生物公司。

1.5 主要儀器 超凈工作臺(tái):蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;倒置顯微鏡:日本Nikon;酶標(biāo)儀:奧地利TZCAN公司。

2 方法

2.1 肺癌動(dòng)物模型 在無(wú)菌條件下，取傳代10 d的Lewis肺癌瘤源小鼠，脫頸椎處死，無(wú)菌操作從腋部皮下剝?nèi)∧[瘤組織，研磨后按1∶3比例加生理鹽水稀釋成瘤細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL，取C57BL/6J小鼠，每鼠0.2 mL右前肢腋部皮下注射。

2.2 動(dòng)物分組及給藥 動(dòng)物造模24 h后，稱(chēng)質(zhì)量隨機(jī)分為模型對(duì)照組，正常動(dòng)物組，中藥高劑量組，中藥中劑量組和中藥低劑量組。每組10只，雌雄各半。分組后，模型對(duì)照組及正常動(dòng)物組，灌胃等容積蒸餾水。復(fù)方桂術(shù)膠囊用蒸餾水稀釋?zhuān)邉┝拷M按20 g/kg(為臨床成人日用量的10倍)灌胃給藥，中劑量組按10 g/kg(為臨床成人日用量的5倍)灌胃給藥，低劑量組按5 g/kg(為臨床成人日用量的2.5倍)灌胃給藥，每日1次，連續(xù)10 d。

2.3 肺癌抑制率的測(cè)定 第11天稱(chēng)體質(zhì)量并處死動(dòng)物，解剖瘤體稱(chēng)質(zhì)量。按下式計(jì)算腫瘤抑制率:腫瘤抑制率=(對(duì)照組平均瘤質(zhì)量－給藥組平均瘤質(zhì)量)/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100%。

2.4 血清TNF-α和IFN-γ質(zhì)量測(cè)定 第11天動(dòng)物稱(chēng)質(zhì)量后，無(wú)菌條件下摘眼球取血，靜置4 h，離心分離血清，置－20℃冰箱備用。根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明，采用ELISA雙抗體夾心法，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)。

血清TNF-α檢測(cè)操作:① 分別將標(biāo)本及不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入96 孔板中(100 μL/孔)，37 ℃ 孵育 90 min，洗板;②加入生物素抗體工作液(100 μL/孔)，37℃孵育60 min，洗板;③ 加入酶結(jié)合物工作液(100 μL/孔)，避光孵育30 min，洗板;④ 加入顯色底物100 μL/孔，37℃避光孵育10～15 min;⑤ 加入終止液100 μL/孔，混勻后即刻測(cè)量 OD450值。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值減去零孔的OD值，手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，以平滑線(xiàn)連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)。通過(guò)標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查其濃度。

血清IFN-γ檢測(cè)操作:① 按標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法加好標(biāo)準(zhǔn)品(100 μL/孔)，在每個(gè)樣品孔中加入50 μL試劑稀釋液和50 μL樣本;② 在樣本和標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50 μL生物素化抗體工作液，室溫(20～25℃)孵育120 min，洗板;③ 加入酶結(jié)合物工作液(100 μL/孔)，室溫(20 ～25 ℃)孵育 60 min，洗板;④ 加入顯色底物100 μL/孔，室溫(20～25℃)，避光孵育10 min;⑤ 加入終止液100 μL/孔，混勻后即刻測(cè)量OD450值。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制及同血清TNF-α。

2.5 觀(guān)察抑瘤作用 第11天處死動(dòng)物后解剖瘤體稱(chēng)質(zhì)量，按下列公式計(jì)算瘤質(zhì)量抑制率:腫瘤抑制率(%)=荷瘤模型空白對(duì)照組平均瘤質(zhì)量－給藥組平均瘤質(zhì)量)/荷瘤模型空白對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100%。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方桂術(shù)膠囊對(duì)小鼠Lewis肺癌的抑制作用 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 復(fù)方桂術(shù)膠囊對(duì)小鼠Lewis肺癌的抑制作用

從表1可以看出，對(duì)小鼠Lewis肺癌，復(fù)方桂術(shù)膠囊高、中劑量組均有顯著的抑瘤作用(P＜0.05)，而低劑量組抑瘤作用則不顯著(P＞0.05)。

3.2 復(fù)方桂術(shù)膠囊對(duì)小鼠Lewis肺癌血清TNF-α的影響結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 復(fù)方桂術(shù)膠囊對(duì)小鼠Lewis肺癌血清TNF-α的影響

從表2可以看出，對(duì)Lewis肺癌小鼠血清TNF-α量，與正常動(dòng)物組相比，模型組顯著降低(P﹤0.001)，中藥高劑量組顯著升高(P﹤0.05)，而中藥中劑量組與中藥低劑量組仍未升高至正常水平，二者有顯著性差異(P﹤0.05)，尤以中藥低劑量組最為顯著(P﹤0.001)。與模型對(duì)照組比較，中藥高、中劑量組小鼠血清TNF-α水平均顯著升高，尤以中藥高中劑量組最為顯著(P﹤0.001)，中藥低劑量組雖有所升高，但不明顯(P＞0.05)。

3.3 復(fù)方桂術(shù)膠囊對(duì)小鼠Lewis肺癌血清INF-γ的影響結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 復(fù)方桂術(shù)膠囊對(duì)小鼠Lewis肺癌血清INF-γ的影響

從表3可以看出，對(duì)Lewis肺癌小鼠血清INF-γ量，與正常動(dòng)物組相比，模型組顯著降低(P＜0.001)，中藥高中低劑量組均顯著降低，尤以中藥中劑量組與中藥低劑量組降低最為顯著(P＜0.001)。與模型對(duì)照組比較，中藥高劑量組小鼠血清INF-γ水平顯著升高(P＜0.001)，而中藥中劑量和低劑量組升高不顯著(P＞0.05)。

4 討論

在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞因子TNF-α與IFN-γ發(fā)揮著不可忽視的作用。目前，TNF-α、IFN-γ可作為腫瘤治療反應(yīng)、治療機(jī)制和治療效果判斷的生物學(xué)指標(biāo)［3］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)方桂術(shù)膠囊能促進(jìn)TNF-α的產(chǎn)生，而且隨著中藥劑量的增大，血清中TNF-α水平顯著提高。TNF-α在腫瘤機(jī)體免疫功能中是非常重要的細(xì)胞因子，近年來(lái)被用于腫瘤細(xì)胞的凋亡及聯(lián)合化療藥物治療，被認(rèn)為是與腫瘤惡化有關(guān)的細(xì)胞因子，與腫瘤惡病質(zhì)有關(guān)，同時(shí)又是一種免疫調(diào)節(jié)因子，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能作用［4-5］。TNF-α具有直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，體現(xiàn)在某些磷脂酶、蛋白酶和核酸酶等，這些酶都是殺傷腫瘤細(xì)胞不可缺少的水解酶。而且，它還可以通過(guò)間接作用殺傷腫瘤細(xì)胞，例如阻斷腫瘤細(xì)胞血液供應(yīng)，增加腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的凝血活性，使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，以及抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移等［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，復(fù)方桂術(shù)膠囊高中低劑量組均能能促進(jìn)IFN-γ的產(chǎn)生，但以中藥高劑量組最為顯著。IFN-γ與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有抗腫瘤細(xì)胞增殖作用，還有免疫調(diào)節(jié)作用，可介導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞的激活，并能直接增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的殺傷能力;可誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞表達(dá) MHC-Ⅱ和MHC-Ⅰ類(lèi)抗原，促進(jìn)靜止的CD4+T細(xì)胞變化為T(mén)h1細(xì)胞，并抑制Th2細(xì)胞的增殖，促進(jìn)CD8+CTL的成熟，增強(qiáng)CD8+CTL和NK細(xì)胞的殺傷活性［7-8］。通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增生，改變腫瘤細(xì)胞表面的性能及誘發(fā)新的抗原而被免疫監(jiān)視細(xì)胞識(shí)別并加以排斥，實(shí)現(xiàn)抗腫瘤效應(yīng)和增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤能力。另外，IFN-γ還可通過(guò)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮其抑制腫瘤血管生長(zhǎng)的作用［9］。并且本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果還顯示，復(fù)方桂術(shù)膠囊對(duì)小鼠肺癌具有顯著的抑制作用，表明復(fù)方桂術(shù)膠囊對(duì)動(dòng)物肺癌的抑制與增強(qiáng)荷瘤小鼠細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ的免疫作用密切相關(guān)。

綜上所述，復(fù)方桂術(shù)膠囊不但能顯著抑制小鼠肺癌，而且能影響荷瘤小鼠外周血清TNF-α及IFN-γ細(xì)胞因子水平，從結(jié)果可以看出:隨著其劑量的增加，可使血清中TNF–α的水平明顯提高，而其還能顯著提高血清中IFN-γ的水平。這為臨床使用復(fù)方桂術(shù)膠囊抗癌機(jī)理從細(xì)胞因子水平上提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。復(fù)方桂術(shù)膠囊的抑瘤作用，是否是其復(fù)方中的某些成分對(duì)腫瘤細(xì)胞具有直接的細(xì)胞毒作用，或是通過(guò)對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用，具體的作用環(huán)節(jié)和作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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