款冬花多糖幾種脫色工藝的研究與對(duì)比

高晶晶， 李穩(wěn)宏， 李婉婷， 蔡 靜， 趙 鵬， 延綏宏， 朱驟海

(西北大學(xué)化工學(xué)院，陜西西安 710069)

款冬花為菊科植物款冬Tussilago farfara的干燥花蕾，又名冬花、九九花等。它是應(yīng)用歷史悠久的中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品［1］，臨床上主要用于新久咳嗽，喘咳痰多，勞嗽咳血等癥［2］。最新研究表明款冬花粗多糖對(duì)體外培養(yǎng)人白血病K562細(xì)胞有顯著的凋亡誘導(dǎo)作用，在治療白血病方面具有良好前景［3］。而目前對(duì)款冬花多糖深入研究報(bào)道較少，為此作者在這方面進(jìn)行了一定的研究。

對(duì)款冬花多糖的脫色是其分離純化工藝中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。目前提取的款冬花多糖顏色一般較深，必須對(duì)其中的色素進(jìn)行脫除。多糖脫色的常用方法有活性炭法、雙氧水法以及樹(shù)脂法等［4］，本實(shí)驗(yàn)對(duì)這幾種常用的方法進(jìn)行了比較研究，以期得到一條適合款冬花多糖脫色的工藝路線。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑 款冬花由陜西省新藥技術(shù)開(kāi)發(fā)中心提供;30%H2O2，考馬斯亮藍(lán)，十六烷基三甲基溴化銨，異辛烷，正己醇，NaCl，苯酚，硫酸等試劑均為分析純;西安市藍(lán)深樹(shù)脂公司提供 LS-21，LS-30，LS-700B，LS-206型大孔吸附樹(shù)脂;西安市藍(lán)曉樹(shù)脂公司提供LXD-762，LSA-700B型大孔吸附樹(shù)脂;722分光光度計(jì)，日本島津公司;ZHWY-200B型恒溫震蕩器，上海智城分析儀有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備款冬花多糖及脫蛋白 將款冬花干燥花蕾粉碎，加入95%的乙醇脫脂，脫脂后的款冬花加入一定量的水，用超聲輔助浸提30 min，抽濾，合并濾液濃縮，然后醇沉，抽濾，濾餅用無(wú)水乙醇、乙醚洗滌數(shù)次，干燥后即可得到黃棕色的款冬花多糖粗品。

將上述粗多糖配制成一定質(zhì)量濃度的粗多糖液，加入一定量Sevage試劑(氯仿-正丁醇為4∶1)，經(jīng)3 000 r/min均質(zhì)機(jī)充分混合后離心，取上清液再加入Sevage試劑按上述方法重復(fù)操作多次，直至蛋白脫除率達(dá)到80%以上為止。

1.2.2 款冬花多糖脫色方法簡(jiǎn)介

方法1 雙氧水氧化法脫色:取脫蛋白后的多糖配制30 mL質(zhì)量濃度為2 mg/mL的粗多糖溶液，調(diào)節(jié)pH為9，加入等體積30%的H2O2，置于45℃恒溫水浴中脫色6 h。

方法2 活性炭吸附脫色:活性炭用重蒸水清洗后過(guò)濾，在120℃下干燥8 h，冷卻備用。取脫蛋白后的多糖配制30 mL質(zhì)量濃度為2 mg/mL的粗多糖溶液，向其中加入1.5%的活性炭，置于45℃恒溫水浴中，脫色2 h。

方法3 反膠束溶液脫色［5］:反膠束溶液的制備方法為準(zhǔn)確移取2 mL正己醇、8 mL異辛烷和0.548 g十六烷基三甲基溴化銨混合。多糖預(yù)處理液的制備方法為配制質(zhì)量濃度為4 mg/mL脫蛋白后粗多糖溶液100 mL，然后在沸水浴中加熱30 min，取出并冷卻至室溫，3 000 r/min下離心3 min，取其中40 mL上清液，并向其中加入0.467 g NaCl，攪拌至全部溶解，備用。最后取3 mL的多糖預(yù)處理液各向其中加入1 mL反膠束溶液，振蕩3 min，靜置30 min，取下層液體測(cè)其色素、多糖及蛋白量。

方法4 大孔吸附樹(shù)脂法脫色:按常規(guī)的樹(shù)脂預(yù)處理方法對(duì)6種樹(shù)脂進(jìn)行處理，通過(guò)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，初選一個(gè)較優(yōu)的樹(shù)脂，對(duì)其進(jìn)行脫色實(shí)驗(yàn)。

1.3 分析方法

1.3.1 測(cè)定多糖中色素量及計(jì)算其脫色率 將款冬花粗多糖的水溶液在波長(zhǎng)為200 nm～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)溶液在280 nm～320 nm處有一個(gè)吸收平臺(tái)，因此將色素的檢測(cè)波長(zhǎng)定為320 nm。

A前、A后分別為脫色前后多糖樣品的吸光度值。

1.3.2 測(cè)定多糖量及計(jì)算多糖保留率 采用苯酚-硫酸法［6］測(cè)定多糖的量。

M前、M后分別為脫色前后的多糖量。

1.3.3 測(cè)定多糖中蛋白量及計(jì)算蛋白去除率采用考馬斯亮藍(lán)法［7］測(cè)定蛋白的量。C前、C后分別為脫色前后的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同脫色方法的結(jié)果和分析 見(jiàn)圖1。

圖1 不同脫色方法結(jié)果比較

由圖1可知，雙氧水脫色法的脫色率和多糖保留率均處于中等水平。其脫色原理是雙氧水在受熱過(guò)程和光照條件下會(huì)迅速分解產(chǎn)生初生態(tài)氧，這種氧會(huì)破壞多糖中的有色物質(zhì)，但其缺點(diǎn)是雙氧水在脫除色素的同時(shí)，它的強(qiáng)氧化性也會(huì)使多糖的羥基等活潑基團(tuán)氧化，使多糖降解，從而降低了多糖的保留率［8］。

活性炭吸附脫色法的脫色率很高，但其缺點(diǎn)是多糖保留率低，是由于活性炭有很強(qiáng)的吸附作用，在吸附色素的同時(shí)也會(huì)吸附大量的多糖，而且采用這種方法脫色后，過(guò)濾起來(lái)也相當(dāng)困難［5］。

反膠束溶液法是一種新型的脫色方法，它的優(yōu)點(diǎn)在于脫色的過(guò)程中不會(huì)破壞多糖，仍然可以保留大部分多糖。但是脫色效果相對(duì)于其它方法不是很明顯，而且在多糖液中加入的反膠束溶液在脫色后很難完全去除干凈，這將會(huì)對(duì)后續(xù)的純化及結(jié)構(gòu)鑒定方面的研究產(chǎn)生一定的影響。

樹(shù)脂吸附脫色法是一種比較好的脫色方法，盡管其脫色率沒(méi)有活性炭法高，但多糖保留率高，并且具有較高的蛋白去除率。因此本實(shí)驗(yàn)又對(duì)樹(shù)脂脫色法進(jìn)行了深入的研究。

2.2 大孔吸附樹(shù)脂法脫色工藝條件優(yōu)化研究

2.2.1 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)優(yōu)選脫色樹(shù)脂 將6種樹(shù)脂用常規(guī)樹(shù)脂處理方法預(yù)處理后各稱(chēng)取1 g(干質(zhì)量)放入具塞錐形瓶中，分別加入100 mL質(zhì)量濃度為2 mg/mL的粗多糖溶液，室溫下置于恒溫振蕩器中，200 r/min，每隔一定時(shí)間取樣測(cè)其色素量，最后測(cè)其多糖保留率和蛋白去除率，結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。

圖2 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

圖3 不同樹(shù)脂靜態(tài)吸附脫色結(jié)果

由圖可見(jiàn)，LXD-762和LS-206兩種樹(shù)脂的脫色率均較高，但LXD-762的多糖保留率明顯較差。因此，選用LS-206對(duì)其脫色性能進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.2.2 動(dòng)態(tài)吸附單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.2.1 上樣速度對(duì)脫色效果的影響 用濕法將處理好的20 mL樹(shù)脂(LS-206，下同)裝入玻璃交換柱，配制粗多糖液20 mL，濃度為4 mg/mL，上柱，迅速調(diào)節(jié)其體積流量為1 BV/h，然后用2 BV的蒸餾水沖洗，后測(cè)脫色液中色素的量，最后將溶液與洗液合并，測(cè)合并液的多糖和蛋白量。然后在相同的條件下對(duì)其它上柱速度1.5 BV/h、2 BV/h、2.5 BV/h、3 BV/h進(jìn)行考察，每一個(gè)實(shí)驗(yàn)均做兩遍，然后取其平均值，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 上柱體積流量對(duì)樹(shù)脂脫色的影響

由圖4可知，上柱體積流量為1 BV/h時(shí)脫色效果較優(yōu)，而且此時(shí)多糖保留率也較好，約為69%。

2.2.2.2 上樣量對(duì)脫色效果的影響 用濕法裝柱，柱體積為20 mL，配制質(zhì)量濃度為4 mg/mL的粗多糖液，體積分別為 10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL，上柱，迅速調(diào)節(jié)體積流量為1 BV/h，然后分別用1 BV、2 BV、3 BV、4 BV、5 BV 的蒸餾水沖洗，后測(cè)脫色液色素量，最后將溶液與洗液合并，測(cè)合并液的多糖和蛋白量，每一個(gè)實(shí)驗(yàn)均做兩遍，然后取其平均值，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 上樣量對(duì)樹(shù)脂脫色的影響

由圖5可知，當(dāng)上樣量為30 mL(即1.5 BV)時(shí)的脫色效果較佳，此時(shí)的多糖保留率約為71%。

2.2.2.3 上樣質(zhì)量濃度對(duì)脫色效果的影響 用濕法裝柱，柱體積為20 mL，分別配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL的粗多糖液30 mL，上柱，迅速調(diào)節(jié)體積流量為1 BV/h，然后用3 BV的蒸餾水沖洗，后測(cè)脫色液色素量，最后將溶液與洗液合并，測(cè)合并液的多糖和蛋白量，每一個(gè)實(shí)驗(yàn)均做兩遍，然后取其平均值，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 上樣質(zhì)量濃度對(duì)樹(shù)脂脫色的影響

由圖6可知，質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)脫色效果較好，但此時(shí)多糖保留率僅為33%，當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為6 mg/mL時(shí)多糖保留率較高為73%，脫色率也較高為94.21%。因此，選用6 mg/mL為適宜上樣質(zhì)量濃度。此時(shí)蛋白去除率為76.50%。

2.2.3 重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照上述最優(yōu)條件進(jìn)行了3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。由表可知在此工藝條件下實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好。

表1 動(dòng)態(tài)吸附驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:雙氧水法、活性炭法和反膠束溶液法對(duì)多糖脫色都有不同程度的損失;樹(shù)脂法不僅脫色效果最好，而且同時(shí)具有多糖保留率高和一定脫除蛋白作用的優(yōu)點(diǎn)。

采用LS-206樹(shù)脂吸附脫色的最佳工藝條件為:體積流量1 BV/h，上樣量為1.5 BV，上樣質(zhì)量濃度為6 mg/mL。采用此工藝對(duì)款冬花多糖提取液脫色率可達(dá)94.19%，多糖保留率為73.02%，蛋白質(zhì)去除率為76.44%。

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