人工栽培和野生獐牙菜中齊墩果酸成分分析和比較研究

周 利， 王先飛， 施超歐， 陳桂琛， 史 萍*

(1.華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237;2.華東理工大學分析測試中心，上海 200237;3.中國科學院西北高原生物研究所，青海西寧 810008)

獐牙菜屬龍膽科Gentianaceae，主要分布于海拔2 200～3 600 m青藏高原和云貴高原的山坡灌草叢中或山谷溪邊，是用于治療黃疸性肝膽疾病和病毒性肝炎的珍稀草本植物，俗稱“藏茵陳”［1］。近年來，隨著我國民族醫(yī)藥的迅速發(fā)展，獐牙菜的需求量快速增加，特別是在植物生長階段的花果期大量采收，導致其資源量銳減和逐漸枯竭，其地域分布亦日益狹窄，野生資源植物瀕臨滅絕［2］。因此，進行人工引種和栽培獐牙菜具有重要意義。經(jīng)過幾年的努力，本課題組已經(jīng)成功完成了包括川西獐牙菜Swertia mussotii和抱莖獐牙菜S.franchetiana等野生獐牙菜類植物的人工引種和栽培［3］，也對植物的部分藥效成分如當藥黃素、龍膽苦苷、芒果苷等作了較系統(tǒng)的研究［4-5］。但對于齊墩果酸在野生和栽培品種的積累狀況還沒有相關(guān)的數(shù)據(jù)。

齊墩果酸是獐牙菜中富含抗肝炎的最主要藥效成分，具有護肝降酶、抗炎、強心利尿、降血糖、抗腫瘤的功效［6-10］，分子式:C30H48O3，分子量:456.71，分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 齊墩果酸分子結(jié)構(gòu)式

是白色針狀結(jié)晶，屬于三萜類，熔點:308～310°C，不溶于水，可溶于乙醇、乙醚、丙酮和三氯甲烷。本實驗研究野生川西獐牙菜和抱莖獐牙菜及人工引種栽培條件下不同部位齊墩果酸的質(zhì)量分數(shù)和變化，為獐牙菜藥材資源的保護和開發(fā)、引種以及合理利用提供依據(jù)。

1 實驗材料、試劑和方法

1.1 實驗供試樣品材料 野生川西獐牙菜和抱莖獐牙菜藥材取自于青海玉樹海拔3 500 m左右山地，由中國科學院西北高原生物研究所盧學峰研究員鑒定;人工栽培獐牙菜采于平安縣海拔2 500 m引種栽培基地，為兩年生草本植物。

1.2 實驗儀器和試劑

1.2.1 實驗儀器 高效液相色譜儀Agilent 1100 Series(Agilent USA)。包括在線真空脫氣系統(tǒng)，四元泵，自動進樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測器;離子阱質(zhì)譜儀LCQ Deca XP Plus(Thermo USA)，ESI負離子檢測定性;臺式離心機 TGL-16B(上海安亭科學儀器廠);索氏回流提取器(玻璃，自制)。

1.2.2 實驗藥品和試劑 齊墩果酸對照品(購自中國藥品生物制品檢定所，批號:110709-200304，供定量測定用);無水乙醇，分析純;甲醇，色譜級;乙腈，色譜級;純水，自制。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品溶液的制備 齊墩果酸在水中溶解度小，但易溶于醇、丙酮、乙酸乙酯等，本實驗參考前人的方法［11-13］，采用75%的乙醇回流提取，具體過程如下:取不同部位根、莖、葉、花和全枝獐牙菜樣品于60℃烘箱干燥8 h，然后粉碎，精密稱取1 g樣品加入75%的乙醇10 mL，索氏回流提取1 h，放冷后濾過，殘渣再按此方法重復提取2次，合并提取液，進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，用75%的乙醇溶解濃縮的提取物，并定容至5 mL量瓶中，取濃縮液1 mL于15 000 r/min離心10 min，取上清液供分析備用。

1.3.2 液相色譜及質(zhì)譜條件 液相色譜條件:Hypersil ODS-2 柱 C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-水溶液(65 ∶35v/v)，柱溫:30 ℃，體積流量:0.8 mL/min，檢測波長:210 nm，進樣量:10 μL，用外標法定量。質(zhì)譜條件:ESI負離子/MS/MS檢測，離子源噴射電壓3.5 kV;毛細管溫度300℃;毛細管電壓15 V;鞘氣和輔助氣均為氮氣，體積流量分別為60arb和15arb;碰撞氣為氦氣;檢測方式采用1～2級全掃描質(zhì)譜。

1.3.3 對照品溶液的制備 精密稱取一定量的齊墩果酸對照品，用甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為0.212 0 mg/mL的貯備液，15 000 r/min離心5 min，上清液作為對照品溶液備用。

1.3.4 精密度試驗 取齊墩果酸對照品溶液(0.212 0 mg/mL)，連續(xù)重復進樣5次，計算齊墩果酸的峰面積，獲得相對標準差值(RSD)。

1.3.5 重復性試驗 精密稱取同一批獐牙菜藥材5份，依上述方法制備樣品溶液，進行重復性的RSD測定。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗 取1.3.1 項樣品溶液，分別在 0、2、4、8、16 h進樣20 μL，測定齊墩果酸的穩(wěn)定性。

1.3.7 加樣回收率試驗 取已知質(zhì)量分數(shù)的藥材樣品5份，分別加入與樣品量之比約為1∶1的齊墩果酸對照品，按樣品制備方法和測試條件測定峰面積，計算樣品回收率。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化 因為齊墩果酸和甲醇有相近的最大紫外吸收波長(λmax)，為了降低流動相對齊墩果酸紫外吸收的干擾，參照李路軍等的方法［13］，研究不同的液相色譜條件和洗脫系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)在本文的色譜條件下檢測，基線平穩(wěn)，分離效果好。圖2為試樣品和齊墩果酸對照品的液相色譜和質(zhì)譜圖譜。由圖2A和圖2B可以看出，齊墩果酸對照品和樣品圖譜結(jié)果一致，樣品的分離度好(圖2B)。采用負離子全掃描模式，均可見齊墩果酸［M-H］－準分子離子峰455.5及455.5的二級質(zhì)譜中都有相同的407.5的特征子離子峰(圖2C、D)，表明此峰為目標物齊墩果酸單一成分。

圖2 試樣和齊墩果酸對照品液相色譜和質(zhì)譜圖譜

2.2 齊墩果酸成分的測定

2.2.1 齊墩果酸標準曲線的制備 分別精密量取上述齊墩果酸對照品備用液 2、5、10、15、20 μL 進樣，以色譜峰面積(Y)對質(zhì)量(X)進行回歸，齊墩果酸標準曲線的線性回歸方程為Y=118.29X，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，說明在 0.424 ～4.24 μg范圍內(nèi)色譜峰面積與齊墩果酸質(zhì)量之間具有良好的線性關(guān)系。

2.2.2 齊墩果酸方法學考察結(jié)果 精密度試驗的RSD為0.95%，表明儀器精密度良好;重復性試驗得到 RSD為1.97%，表明該方法的重復性較好。樣品穩(wěn)定性試驗的RSD為2.86%，表明該方法提取獲得樣品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定;回收率試驗表明，目標物齊墩果酸的回收率可達98.60%，RSD為2.22%。因此本實驗采用的齊墩果酸測定方法是可靠的。

2.2.3 樣品中齊墩果酸的測定 精確取樣品溶液20 μL進樣測定齊墩果酸峰面積，重復3次。根據(jù)3次面積的平均值，從標準曲線計算樣品中齊墩果酸質(zhì)量分數(shù)。結(jié)果見表1。

對兩種野生和人工栽培獐牙菜植物的整株以及花、莖、葉、根不同部位齊墩果酸分析計算結(jié)果如表1所示。由表1結(jié)果可以看出，無論是野生的還是人工栽培的獐牙菜，整株抱莖獐牙菜中齊墩果酸質(zhì)量分數(shù)均高于川西獐牙菜中齊墩果酸的質(zhì)量分數(shù)，高出30%以上;川西獐牙菜和抱莖獐牙菜兩個品種，無論是整株還是花、莖、葉和根不同部位，野生品種和人工栽培品種中齊墩果酸質(zhì)量分數(shù)差異不大。由表1的結(jié)果還可以看出，獐牙菜植物不同部位花、葉、莖和根其齊墩果酸質(zhì)量分數(shù)不盡相同，花和葉質(zhì)量分數(shù)最高，植物根中質(zhì)量分數(shù)最低;花和葉中齊墩果酸質(zhì)量分數(shù)高出植物莖的質(zhì)量分數(shù)近5倍、高出植物根的質(zhì)量分數(shù)10倍以上。

表1 獐牙菜不同部位中齊墩果酸

3 結(jié)論

液相色譜條件采用乙腈-水溶液(65∶35v/v)流動相，體積流量0.8 mL/min，210 nm檢測波長，對照品和樣品基線平穩(wěn)、分離度良好。質(zhì)譜分析表明為單一目標成分。引種到低海拔的兩種獐牙菜，無論是川西獐牙菜還是抱莖獐牙菜，野生和人工栽培植物全株中齊墩果酸的質(zhì)量分數(shù)無顯著變化。對野生和人工栽培不同生境條件下生長的獐牙菜，整株抱莖獐牙菜中齊墩果酸量均高于川西獐牙菜中齊墩果酸的質(zhì)量分數(shù)，花、葉、莖和根不同部位齊墩果酸質(zhì)量分數(shù)不盡相同，齊墩果酸主要集中在植物的花和葉中，花和葉中齊墩果酸最高，植物根中齊墩果酸質(zhì)量分數(shù)最低，不到花或葉質(zhì)量分數(shù)的十分之一。結(jié)果表明人工栽培的川西獐牙菜和抱莖獐牙菜藥材仍具有優(yōu)良的品質(zhì).

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