HPLC法測定白芪龍膠囊中齊墩果酸和熊果酸

劉玉軍， 代 龍， 孫明江， 馬 睿

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355)

白芪龍膠囊是由白花蛇舌草、黃芪、天龍等多味 中藥經(jīng)先進(jìn)的專利制備工藝制得的抗腫瘤六類新藥，用于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、肝癌等多種惡性腫瘤的治療或輔助治療，效果顯著。白花蛇舌草為方中君藥，現(xiàn)代研究表明［1］，其主要含齊墩果酸、熊果酸、黃酮類及多糖類成分，齊墩果酸具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞吞噬的功能，以及遲發(fā)超敏反應(yīng)的效應(yīng);熊果酸在與齊墩果酸相同的劑量下，對(duì)正常小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能同樣具有較明顯的增強(qiáng)作用。為有效控制本制劑質(zhì)量，保證其良好的抗腫瘤效果，筆者建立了HPLC法同時(shí)測定白芪龍膠囊中齊墩果酸和熊果酸的定量測定方法，從而為白芪龍膠囊質(zhì)控方法的建立提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC－2010A型高效液相色譜儀，包括:UV檢測器、CLASS-VP工作站(日本島津公司);UV1100型紫外分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司);AB135-S電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);KQ-250型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 齊墩果酸對(duì)照品(110709-200505)、熊果酸對(duì)照品(110742-200516)，均購自中國藥品生物制品檢定所;白芪龍膠囊(批號(hào) 20100301，20100302，20100401)，自制;甲醇、乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相 甲醇-乙腈-0.1% 冰醋酸(80∶5∶15);檢測波長215 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫40℃。理論板數(shù)按熊果酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別取齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并制成每1 mL含齊墩果酸0.102 6 mg和熊果酸0.203 6 mg的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍哭D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 取白花蛇舌草以外的其余藥味，制得不含白花蛇舌草的空白制劑，照供試品溶液的制備方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 精密吸取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果供試品中齊墩果酸和熊果酸色譜峰能達(dá)到基線分離，且保留時(shí)間與相應(yīng)對(duì)照品一致;陰性對(duì)照溶液在對(duì)應(yīng)保留時(shí)間處無吸收峰，表明其余藥味對(duì)齊墩果酸和熊果酸的測定無干擾，結(jié)果見圖1～3。

圖1 混合對(duì)照品HPLC圖

圖2 供試品HPLC圖

圖3 陰性對(duì)照HPLC圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣 4、6、8、10、20、30 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。以齊墩果酸、熊果酸進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程分別為:Y=490 276.942 1X－ 1 265.765 3，r=0.999 9;Y=457 259.686 7X+14 380.960 3，r=0.999 9。結(jié)果表明，齊墩果酸、熊果酸進(jìn)樣量分別在0.410 4～3.078 0 μg、0.814 4 ～ 6.108 0 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，重復(fù)測定5次，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果齊墩果酸、熊果酸峰面積的 RSD 分別為 1.32%(n=5)、0.92%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取上述供試品溶液(批號(hào)20100401)分別于配制后的1、3、5、7、9、12 h 測定齊墩果酸和熊果酸峰面積，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果齊墩果酸、熊果酸峰面積的RSD分別為0.75%(n=6)、0.81%(n=6)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次白芪龍膠囊(批號(hào)20100401)內(nèi)容物，共5份，分別按2.2.2項(xiàng)下方法制得供試品溶液，照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果制劑中齊墩果酸、熊果酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 0.338 4 mg/g、1.268 3 mg/g，RSD 分別為1.49%(n=5)、1.05%(n=5)，表明本測定方法重復(fù)性較理想。

2.3.6 加樣回收試驗(yàn) 取已測定的白芪龍膠囊(批號(hào)20100401，含齊墩果酸 0.338 4 mg/g，熊果酸1.268 3 mg/g)內(nèi)容物，共5份，各約1g，精密稱定，分別精密加入混合對(duì)照品溶液(齊墩果酸0.020 52 mg/mL、熊果酸0.040 72 mg/mL)和甲醇各 25 mL，稱定質(zhì)量，其余按2.2.2項(xiàng)下方法操作，制得供試品溶液，照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，進(jìn)樣量10 μL，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.4 樣品測定 取3批樣品按供試品溶液制備法制得供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，每批樣品測定3份，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算，結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果(n=3)

根據(jù)上述測定結(jié)果及《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中白花蛇舌草項(xiàng)下的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低限(總和≥0.08%)，確定本制劑中齊墩果酸和熊果酸總和的低限為0.83 mg/g［600 g藥材 ×0.08% ×60%(轉(zhuǎn)移率)÷(1 000粒 ×0.35 g/粒)=0.822 8 mg/g］，3 批制劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在低限以上，表明所制定的質(zhì)量分?jǐn)?shù)限度(總和≥0.83 mg/g)是合理的。

3 討論

3.1 齊墩果酸和熊果酸結(jié)構(gòu)中均無共軛體系存在，僅為末端吸收。經(jīng)200～600 nm全波長掃描發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸和熊果酸的最大吸收在206 nm左右，考慮甲醇在此波長范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的末端吸收，對(duì)測定結(jié)果干擾較嚴(yán)重，參考相關(guān)文獻(xiàn)［2-6］，最終確定在215 nm處測定齊墩果酸和熊果酸。

3.2 齊墩果酸和熊果酸同屬于五環(huán)三萜類化學(xué)物，為同分異構(gòu)體，極性相似，難以有效分離。筆者參考大量相關(guān)文獻(xiàn)［7-11］，分別考察了甲醇-水(0.04%磷酸二氫鉀)(87 ∶13)、甲醇-水(82 ∶18)、乙腈-甲醇－0.5%醋酸銨溶液(70∶10∶20)、甲醇-乙腈 －0.1%冰醋酸(83 ∶5 ∶12)、甲醇 －0.5%醋酸銨溶液(90 ∶10)、乙腈-甲醇-水-磷酸-三乙胺(50 ∶30 ∶20∶0.02 ∶0.04)等的分離效果，發(fā)現(xiàn)甲醇-乙腈 －0.1%冰醋酸(83∶5∶12)最佳，并進(jìn)一步調(diào)整流動(dòng)相比例為80∶5∶15。此時(shí)，齊墩果酸和熊果酸達(dá)到基線分離，且基線平穩(wěn)、峰形對(duì)稱，陰性無干擾。

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