參芪扶正注射液在癌因性疲乏中作用的研究

于 碩， 趙曉東， 張麗莉， 張文杰， 程建新

(1.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院河北石家莊 050000;2.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院河北石家莊 050011)

癌癥是目前臨床危害人類健康和導致死亡的主要疾病。癌因性疲乏(Cancer-Related Fatigue，CRF)是癌癥患者最常見的主觀癥狀之一，可由癌癥引起，或是癌癥治療的結(jié)果。癌癥患者的疲乏發(fā)生率為34% ～76%，接受化療的病人有75%～96%會產(chǎn)生疲乏，且持續(xù)時間長，極大地影響患者的生活質(zhì)量，成為治療和康復的重要影響因素。因此，探索癌因性疲乏的病理生理機制以制定出行而有效的預防和治療的策略是非常有必要的。目前提出的疲乏病因機制假說包括:5-羥色胺(5-HT)失調(diào)，迷走傳入神經(jīng)的激活，肌肉的改變和ATP代謝異常，下丘腦-垂體-腎上腺軸功能異常和24 h節(jié)律異常以及促細胞素失調(diào)。機體活動主要是指骨骼肌的運動，而骨骼肌的活動需要能量供應才能實現(xiàn)，能源物質(zhì)在機體主要以ATP(三磷酸腺苷)的形式存在，可以為多種細胞功能活動提供能量尤其是肌肉細胞的活動。ATP是在機體的‘能量加工廠’——線粒體中生成的，在線粒體內(nèi)表面附著許多小顆粒，它們是三磷酸腺苷酶，參與能量的轉(zhuǎn)換，因此說線粒體是營養(yǎng)物質(zhì)氧化代謝產(chǎn)生能量的主要細胞器，它存在于肌細胞內(nèi)可將人體中的糖原、葡萄糖、自由脂肪酸等能源物質(zhì)進行代謝反應，生成直接能源ATP供機體活動所需［1-3］。所以在骨骼肌中線粒體的多少、大小、形狀等均反映了機體肌肉的功能狀態(tài)，從而反映了肌肉是否疲勞及疲乏程度。在我國傳統(tǒng)醫(yī)學中疲勞也是常見的臨床癥狀，常被描述為‘懈惰、四肢勞倦、四肢不欲動、神疲乏力’等，按中醫(yī)臟象學說，軀體的乏力及易疲勞與脾、肝、腎三臟有直接關(guān)系，因此運用調(diào)理肝脾、補氣理氣的培本扶正中藥有助于消除疲乏［4］。本實驗將就此加以研究和驗證。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

BALB/C裸鼠130只，雌雄兼用，體質(zhì)量26～28g，6周齡，由中國藥品生物制品檢定所實驗動物資源中心提供(實驗動物合格證號SCXK(京)2005-0004)。飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學分子生物學研究所SPF級動物室內(nèi)。

1.2 細胞株

人胃癌BGC-823細胞株，由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院腫瘤研究所提供，取2.5×106/mL細胞濃度，0.2 mL/只行裸鼠注射。

1.3 實驗器材

水迷宮(中國醫(yī)學科學院藥物研究所研制);開闊箱(本實驗依有關(guān)文獻制作);透射電鏡(日本電子JEM-1230);高效液相色譜儀;配SPD-10Avp紫外檢測器、7725i定量進樣器裝置、C18色譜柱(LC-10ATvp日本島津公司)

1.4 實驗藥物

參芪扶正注射液(麗珠集團利民制藥廠生產(chǎn));250 mL/支，含黨參、黃芪、氯化鈉等;國藥準字Z19990065。

5-氟尿嘧啶注射液(天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn))0.25 g/10mL/支，國藥準字 H12020959。

三磷酸腺苷(標準品，Sigma公司產(chǎn)品)。

2 方法

2.1 癌因性疲乏動物模型的建立

2.1.1 分組:把裸鼠隨機分為正常對照組(10只)、模型對照組(30只)(其中輕度疲乏組10只、中度疲乏組10只、重度疲乏組10只)、治療組(90只)(其中輕度疲乏組30只、中度疲乏組30只、重度疲乏組30只，每組再分3個治療小組，分別是參芪扶正注射液注射組、5-氟尿嘧啶注射組、參芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶聯(lián)合注射組，每組各10只)。

2.1.2 動物模型的建立:⑴將凍存于液氮中BGC-823細胞取出，解凍培養(yǎng)，使用細胞計數(shù)板計數(shù)，按照2.5×106/mL細胞濃度，0.2 mL/只注射到裸鼠。⑵裸鼠飼養(yǎng)于室溫(22±2)℃、正常光照的SPF級動物室中5只/籠，按照50 mg/kg的劑量以氯胺酮行腹腔注射麻醉裸鼠，常規(guī)消毒皮膚，沿左側(cè)正中旁線切開，刀口約1.0 cm，小心暴露腹膜與胃壁，用一次性注射器將腫瘤細胞注射于胃壁漿膜層，縫合腹壁及皮膚。⑶以鈷60滅菌飼料喂養(yǎng)，每日觀察裸鼠的飲水量、進食量、體質(zhì)量、皮毛色澤、日常活動及糞便情況。在出現(xiàn)活動減少、皮色變暗、體質(zhì)量減輕、飲水進食量減少時，開始行為學方面的測定以了解疲乏程度。⑷ a、學習記憶情況的觀測(水迷宮):此實驗可作為腦力疲乏的評定標準之一，可根據(jù)出離迷宮時間的不同來判定疲乏的程度:輕度疲乏約為(89.69 ±26.38)s，中度疲乏約為(113.62 ±33.72)s，重度疲乏約為(136.44 ±41.56)s。b、曠場實驗(開闊法):此實驗可作為腦力疲乏的評定標準之一(觀察裸鼠在開闊箱正中格內(nèi)的活動情況，包括在正中格停留時間、方格間穿行次數(shù)即三爪以上跨入臨格的次數(shù)、豎起時間即兩前肢離地1cm以上的時間)。c、鼠尾懸掛實驗:此實驗可作為體力疲乏的評定標準之一(觀察裸鼠在倒掛狀態(tài)下6 min內(nèi)的不動時間)。d、力竭游泳實驗:此實驗可作為體力疲乏的評定標準之一(記錄裸鼠從入水到頭部沉入水中10 s不能浮出水面的時間)。依據(jù)此四試驗將疲乏程度分為輕度、中度和重度疲乏。

2.2 治療藥物的應用

在判定裸鼠出現(xiàn)疲乏及評定分級后，對治療組裸鼠進行藥物經(jīng)鼠尾靜脈注射，依注射藥物的不同分為參芪扶正注射液注射組、5-氟尿嘧啶注射組、參芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶聯(lián)合注射組，此分組相當于培本扶正治療組、化療組、培本扶正聯(lián)合化療組。各組注射劑量為參芪扶正注射液4 g/kg(相當于2 mL/kg)(此劑量與臨床常用劑量250 mL/天/人是相當?shù)?，5-氟尿嘧啶25 mg/kg(相當于1 mL/kg)，均連續(xù)注射5 d，而后進行ATP水平檢測和電鏡觀察。

2.3 取材及樣本處理

摘除裸鼠眼球，由眼后靜脈取血后處死裸鼠，在放有冰塊的搪瓷盤中迅速剪開下肢皮膚，取出腓腸肌，按電鏡標本制作要求制作(詳見腓腸肌超微結(jié)構(gòu)觀察)。血液予以低速離心(4 000 r/min，10 min)，取上清液以1∶1滴入乙腈，充分混勻，在4℃離心機離心(12 000 r/min，5 min)，取上清液備用。

2.4 ATP水平的測定:高效液相色譜法

高效液相色譜配合樣品衍生化后用熒光檢測器分析波長，流動相為甲醇-醋酸鈉=15∶85(V∶V)，波長260 nm，進液量為10 μL，用外標法定量。

2.5 腓腸肌超微結(jié)構(gòu)觀察

取材、固定、脫水、包埋、切片染色后進行透射電鏡觀察、拍片、記錄。

2.6 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計軟件采用SAS6.0分析，實驗結(jié)果均以平均值±標準差(±s)表示，組間差異采用方差分析，用Q檢驗。P＜0.05，有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 ATP 測定結(jié)果

各疲乏狀態(tài)治療組裸鼠的血漿ATP水平均低于正常對照組。見表1。

表1 各治療組中ATP水平的比較 (ng/mL)

3.1.1 輕度疲乏組:各治療組裸鼠的血漿ATP水平均低于正常對照組。

參芪扶正注射液注射組與正常對照組比較、與參芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶聯(lián)合注射組比較、與模型對照組比較均為P＜0.05，有顯著差異;與5-氟尿嘧啶注射組比較P＜0.01，有明顯差異。

參芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶聯(lián)合注射組與正常對照組比較，P＜0.01，有明顯差異;與5-氟尿嘧啶注射組比較、與模型對照組比較均為P＜0.05，有顯著差異。

5-氟尿嘧啶注射組與正常對照組比較，P＜0.01，有明顯差異;與模型對照組比較P＜0.05，有顯著差異。

模型對照組與正常對照組比較P＜0.01，有明顯差異。

3.1.2 中度疲乏組:各治療組裸鼠的血漿ATP水平均低于正常對照組。

參芪扶正注射液注射組與正常對照組比較、與5-氟尿嘧啶注射組比較均為P＜0.01，有明顯差異;而與參芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶聯(lián)合注射組比較、與模型對照組比較均為P＜0.05，有顯著差異。

參芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶聯(lián)合注射組與正常對照組比較，P＜0.01，有明顯差異;與5-氟尿嘧啶注射組比較、與模型對照組比較均為P＜0.05，有顯著差異。

5-氟尿嘧啶注射組與正常對照組比較，P＜0.01，有明顯差異;與模型對照組比較，P＜0.05，有顯著差異。

模型對照組與正常對照組比較，P＜0.01，有明顯差異。

3.1.3 重度疲乏組:各治療組裸鼠的血漿ATP水平均低于正常對照組。

參芪扶正注射液注射組與正常對照組比較、與5-氟尿嘧啶注射組比較均為P＜0.01，有明顯差異;與參芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶聯(lián)合注射組比較、與模型對照組比較均為P＜0.05，有顯著差異。

參芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶聯(lián)合注射組與正常對照組比較，P＜0.01，有明顯差異;與5-氟尿嘧啶注射組比較、與模型對照組比較均為P＜0.05，有顯著差異。

5-氟尿嘧啶注射組與正常對照組比較，P＜0.01，有明顯差異;與模型對照組比較，P＜0.05，有顯著差異。

模型對照組與正常對照組比較，P＜0.01，有明顯差異。

3.2 腓腸肌超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察 均為(×20K)電鏡下觀察。

3.2.1 正常對照組可見肌原纖維排列整齊、肌節(jié)正常、線粒體在肌原纖維間成對排列且外膜完整，見圖1。

圖1 正常對照組腓腸肌超微結(jié)構(gòu)

3.2.2 輕度疲乏組:輕度疲乏單用參芪扶正注射液注射組和輕度疲乏應用參芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶聯(lián)合注射組在鏡下表現(xiàn)基本相同:可見肌原纖維間輕度水腫，線粒體個別腫脹明顯，局部嵴消失，僅在后者個別外膜不完整;模型對照組和輕度疲乏單用5-氟尿嘧啶治療組在鏡下表現(xiàn)基本相同:可見肌原纖維間輕度水腫，線粒體多數(shù)腫脹明顯，局部嵴消失，個別外膜不完整，線粒體成對排列現(xiàn)象消失，排列紊亂，僅在后者見部分肌節(jié)旁線粒體缺失，見圖2。

3.2.3 中度疲乏組:中度疲乏單用參芪扶正注射液注射組可見肌原纖維間個別線粒體腫脹，局部嵴消失，部分嵴排列稀疏，外膜尚完整，但肌原纖維間輕度水腫;中度疲乏應用參芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶聯(lián)合注射組和模型對照組在鏡下均可見肌原纖維間排列紊亂，不同程度的肌絲溶解，線粒體多數(shù)腫脹明顯，局部嵴消失，個別外膜不完整，部分肌節(jié)旁線粒體缺失，線粒體排列紊亂，外形不規(guī)整，線粒體成對排列現(xiàn)象消失;中度疲乏單用5-氟尿嘧啶治療組可見肌原纖維不連續(xù)，肌絲溶解，線粒體多數(shù)腫脹明顯，大部分嵴排列紊亂、消失，大部分線粒體外膜不完整，部分肌節(jié)旁線粒體缺失，線粒體排列紊亂，外形不規(guī)整，線粒體成對排列現(xiàn)象消失，見圖3。

圖2 輕度疲乏組腓腸肌超微結(jié)構(gòu)

圖3 中度疲乏組腓腸肌超微結(jié)構(gòu)

3.2.4 重度疲乏組:重度疲乏單用參芪扶正注射液注射組可見肌原纖維間水腫，部分肌節(jié)旁線粒體消失，部分線粒體腫脹明顯，嵴豐富，外膜完整;重度疲乏應用參芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶聯(lián)合注射組可見肌原纖維間水腫，大部分線粒體腫脹，外膜不完整，局部的嵴排列紊亂、消失;模型對照組和重度疲乏單用5-氟尿嘧啶治療組可見不同程度的肌原纖維不連續(xù)，肌絲溶解，線粒體多數(shù)腫脹明顯，外膜不完整，部分肌節(jié)旁線粒體缺失，大部分線粒體嵴排列紊亂、消失，見圖4。

圖4 重度疲乏組腓腸肌超微結(jié)構(gòu)

4 討論

現(xiàn)代生理學研究認為機體的日常活動是依靠骨骼肌的一系列收縮舒張的細胞學機制來完成實現(xiàn)的。此機制包括兩個主要方面:㈠骨骼肌收縮:①興奮—收縮耦聯(lián):首先肌細胞膜的興奮(動作電位)沿肌細胞膜以局部電流的形式傳播，沿肌細胞的橫管系統(tǒng)傳入肌細胞的深部，導致三聯(lián)管興奮，使縱管系統(tǒng)的終末池對Ca2+的通透性增加，Ca2+由終末池釋放到細胞漿中，使細胞漿Ca2+濃度瞬間升高100倍，Ca2+擴散并與細絲中的肌鈣蛋白結(jié)合，肌鈣蛋白分子空間構(gòu)型改變，失去固定作用，使細絲中的原肌球蛋白從其阻礙位置上移開，從而暴露細絲中的肌動蛋白分子上橫橋的結(jié)合位點，使橫橋與肌動蛋白結(jié)合，觸發(fā)橫橋擺動。②橫橋擺動引起肌小節(jié)中粗細肌絲相互滑行，橫橋循環(huán)擺動包括以下四個步驟:⑴粗肌絲上獲能的肌球蛋白橫橋與肌動蛋白結(jié)合;⑵這種結(jié)合觸發(fā)了儲存于肌球蛋白中的能量釋放，導致每個橫橋產(chǎn)生一個角運動;⑶ATP與肌球蛋白結(jié)合，打破了肌動蛋白和肌球蛋白的結(jié)合，允許橫橋與肌動蛋白解離;⑷結(jié)合到肌球蛋白上的ATP通過內(nèi)源性分解，將能量傳遞給肌球蛋白的橫橋，產(chǎn)生一種獲能的橫橋。以上循環(huán)不斷重復，導致肌小節(jié)中粗細肌絲不斷滑行，使肌肉收縮。㈡收縮的肌肉舒張:對肌肉的刺激終止，肌細胞膜電位回復靜息電位，縱管系統(tǒng)的終末池對Ca2+的通透性降低，同時啟動了終末池上的Ca2+泵，依靠ATP分解放能將細胞漿中的Ca2+泵回終末池內(nèi)，使細胞漿中的Ca2+濃度降低，導致肌鈣蛋白與Ca2+解離，肌鈣蛋白重新將原肌球蛋白固定于肌動蛋白上橫橋的結(jié)合位點上面，阻斷了橫橋與肌動蛋白的結(jié)合，導致肌肉舒張。由此可見，肌肉的收縮和舒張都有賴于ATP功能，因此ATP的缺乏勢必將導致肌肉收縮和舒張功能的障礙［5-7］。

生物能量學認為線粒體在生命活動中具有主要的作用，被稱為‘生物鐘’故線粒體的老化是細胞衰弱的一種表現(xiàn)和重要原因［8］。同時線粒體也是真核細胞內(nèi)的一種重要和獨特的細胞器，是細胞進行呼吸鏈、電子傳遞、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化的場地，其中有氧呼吸是線粒體中可控制的一個通過Krebs循環(huán)使還原態(tài)有機復合物氧化產(chǎn)生CO2的過程，在Krebs循環(huán)過程中，釋放的電子通過含有4個呼吸復合體的電子傳遞鏈傳遞，最終把CO2還原為H2O，自由能隨著電子傳遞而釋放，用于產(chǎn)生跨越線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子梯度，最后儲存于質(zhì)子梯度中的勢能驅(qū)動ATP合酶使ADP磷酸化產(chǎn)生ATP，這是所有線粒體所共有的呼吸作用的基本功能［9-11］。故線粒體是動物細胞內(nèi)主要的ATP生產(chǎn)中心，能生成細胞生命活動所需的能量，其病變影響細胞各成分的協(xié)調(diào)并危及細胞生命活動。由此可見，線粒體的結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)影響著ATP的生產(chǎn)，是機體肌肉活動正常與否的標志。

由ATP測定結(jié)果可見在輕度、中度和重度疲乏狀態(tài)的各治療組的裸鼠中，ATP的水平均低于正常對照組的裸鼠，且有統(tǒng)計學意義(輕度疲乏參芪扶正注射液注射組與正常對照組比較P＜0.05，輕度疲乏參芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶聯(lián)合注射組、5-氟尿嘧啶注射組、模型對照組與正常對照組比較P＜0.01，中度和重度疲乏各治療組與正常對照組比較P＜0.01)。而在各級疲乏狀態(tài)的裸鼠中，參芪扶正注射液注射組的ATP水平高于參芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶聯(lián)合注射組、5-氟尿嘧啶注射組和模型對照組(輕度、中度和重度疲乏組P＜0.05);參芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶聯(lián)合注射組的ATP水平高于5-氟尿嘧啶注射組和模型對照組(輕度、中度和重度疲乏組P＜0.05);模型對照組的ATP水平高于5-氟尿嘧啶注射組(輕度、中度和重度疲乏組P＜0.05)。由此可見，在疲乏狀態(tài)下的裸鼠在應用參芪扶正注射液治療后，ATP水平得到提升，而應用5-氟尿嘧啶治療后，ATP水平反而比模型對照組的還低，說明作為培本扶正補氣理氣的中成藥——參芪扶正注射液確實具有增強機體機能，改善疲勞狀態(tài)，恢復機體體力，固元培本的效能［12］;而5-氟尿嘧啶作為化療藥物在機體出現(xiàn)疲乏狀態(tài)后繼續(xù)應用，可使機體的疲勞程度進一步加重，影響機體的康復，如確需應用5-氟尿嘧啶治療可聯(lián)合參芪扶正注射液協(xié)同治療，可達到減弱5-氟尿嘧啶毒副作用，緩解疲勞的目的。

由腓腸肌超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察結(jié)果可見在輕度、中度和重度疲乏組裸鼠的腓腸肌電鏡顯示肌原纖維均有不同程度的間隙水腫、纖維斷裂不連續(xù)和肌絲溶解(輕度疲乏組變化最輕，重度疲乏組變化最重);顯示線粒體均有不同程度的體積腫脹、肌節(jié)旁成對線粒體缺失、嵴排列紊亂和消失、外膜不完整等(輕度疲乏組變化最輕，重度疲乏組變化最重);而在各級疲乏狀態(tài)下的各治療組中顯示單用參芪扶正注射液注射組的肌原纖維和線粒體的改變好于參芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶聯(lián)合注射組，參芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶聯(lián)合注射組的改變好于模型對照組，模型對照組的改變好于5-氟尿嘧啶注射組。這與ATP水平的測定結(jié)果相一致，從微觀角度也說明參芪扶正注射液對于癌因性疲乏具有一定的治療作用，體現(xiàn)在改善線粒體的功能狀態(tài)，增加ATP的水平。從另一方面來講，肌肉改變和ATP水平的減少可作為出現(xiàn)癌因性疲乏的病因之一［13-15］。

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