小兒和胃利脾顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

鄒 禹， 李 卿， 秦 劍

(1.重慶市第九人民醫(yī)院，重慶 400700;2.重慶市中藥研究院，重慶 400065)

小兒和胃利脾顆粒是在多年使用的臨床驗(yàn)方基礎(chǔ)上，經(jīng)現(xiàn)代工藝制成的中藥復(fù)方制劑，本品由雞內(nèi)金、山藥、三七、黃芪等藥材組成，臨床證實(shí)具有開(kāi)胃健脾功效，用于小兒脾虛胃弱，食欲不振，營(yíng)養(yǎng)不良，發(fā)育遲緩，面色萎黃等癥。本研究用薄層色譜法在同一色譜條件下對(duì)制劑中的三七、黃芪進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法測(cè)定三七中的有效成分三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、黃芪中黃芪甲苷，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于該制劑的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)控制成分。

1 儀器與試藥

1100高效液相色譜儀(美國(guó)惠普公司)，Waters2695液相色譜儀(美國(guó) Waters公司)，Alltech 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)奧泰公司)，薄層成像色譜儀(瑞士卡瑪公司);三七皂苷R1對(duì)照品(批號(hào):0745-9804)、人參皂苷 Rb1對(duì)照品(批號(hào):0703-200118)、人參皂苷Rg1對(duì)照品(批號(hào):110704-200318)、黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào):0781-9807)，供定量測(cè)定用，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;硅膠G(青島海洋化工廠，薄層層析用);小兒和胃利脾顆粒(本院自制);乙腈為色譜純;水為去離子水;其余試劑均為分析純。

2 三七、黃芪的薄層鑒別

取本品4 g，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5 mL使溶解，用水飽和正丁醇提取4次，每次20 mL，合并水飽和正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次40 mL，棄去氨試液，水飽和正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述5種溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 三七、黃芪薄層色譜圖1.缺黃芪陰性樣品 2-4.小兒和胃利脾顆粒 5.缺三七陰性樣品6.黃芪甲苷對(duì)照品 7.混合對(duì)照品 8.三七皂苷R1對(duì)照品9.人參皂苷Rb1對(duì)照品 10.人參皂苷Rg1對(duì)照品Fig.1 TLC of Notoginseng Radix et Rhizoma and Astragali Radix1.negative sample without Astragali Radix 2-4.samples 5.negative sample without Notoginseng Radix et Rhizoma 6.astragaloside IV 7.mixed reference substances 8.notoginsenoside R1 9.ginsenoside Rb1 10.ginsenoside Rg1

3 三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1定量測(cè)定

3.1 色譜條件 色譜柱 Phenomenex C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;體積流量為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm;柱溫30℃。理論板數(shù)按三七皂苷R1峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

表1 梯度洗脫Tab.1 Gradient elution

3.2 供試品溶液的制備 取本品約3 g，精密稱定，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5 mL使溶解，用水飽和正丁醇提取4次，每次20 mL，合并水飽和正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次40 mL，棄去氨試液，水飽和正丁醇液蒸干，殘?jiān)眉状歼m量使溶解，移置5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

3.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取三七皂苷R1對(duì)照品、人參皂苷Rb1對(duì)照品、人參皂苷Rg1對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含三七皂苷R10.21 mg、人參皂苷 Rb10.38 mg、人參皂苷 Rg10.35 mg的混合溶液，即得。

3.4 陰性對(duì)照樣品溶液的制備 取不含三七的陰性樣品適量，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照樣品溶液。

3.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL，依照上述色譜條件測(cè)定。陰性對(duì)照溶液在混合對(duì)照品相同保留時(shí)間位置上未見(jiàn)色譜峰，說(shuō)明陰性無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。3.6 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液2、4、8、16、20 μL，注入液相色譜儀，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，分別得回歸方程。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 線性回歸方程 (n=5)Tab.2 Equations of linear regression (n=5)

3.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積值，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷 Rg1峰面積的 RSD分別為0.78%、0.85%和 0.90%(n=6)。表明儀器精密度良好。

圖2 高效液相色譜圖A.對(duì)照品 B.供試品 C.缺三七陰性供試品 1.三七皂苷R12.人參皂苷Rg13.人參皂苷Rb1Fig.2 HPLC chromatogramsA.reference substance B.sample C.negative sample without Notoginseng Radix et Rhizoma 1.notoginsenoside R1 2.ginsenoside Rg1 3.ginsenoside Rb1

3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、1、4、8、10、12 h 進(jìn)樣，三七皂苷 R1、人參皂苷 Rb1、人參皂苷Rg1峰面積的RSD分別為0.88%、0.97%和0.95%(n=6)。結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品6份，照供試品溶液制備方法，測(cè)定，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1質(zhì)量分?jǐn)?shù)RSD分別為1.04%、1.16%和0.97%(n=6)，表明本試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

3.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)定的同批樣品6份，分別精密加入三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1對(duì)照品適量，照供試品溶液制備方法，按確定的色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

3.11 樣品測(cè)定 稱取供試品3.0 g，精密稱定，制備供試品溶液，按3.1項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)Tab.3 Results of revovery test(n=6)

表4 樣品測(cè)定結(jié)果 (n=3)Tab.4 Results of sample determination (n=3)

4 黃芪甲苷測(cè)定

4.1 色譜條件 色譜柱:Waters symmetry C18色譜柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-水(30∶70);體積流量為0.8 mL/min;檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器;漂移管溫度70℃;柱溫30℃。理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

4.2 供試品溶液的制備 取本品約5 g，精密稱定，加甲醇40 mL，超聲處理35 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5 mL使溶解，用水飽和正丁醇提取4次，每次30 mL，合并水飽和正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次60 mL，棄去氨試液，水飽和正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，通過(guò)D101型大孔樹(shù)脂柱(2.5 g，內(nèi)徑 1 cm)，以水60 mL 洗脫，棄去過(guò)柱液及水洗液，再用20%乙醇50 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用60%乙醇50 mL洗脫，收集60%乙醇洗脫液，蒸干，殘?jiān)眉状歼m量使溶解，移置5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

4.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.38 mg的溶液，即得。

4.4 陰性對(duì)照樣品溶液的制備 取不含黃芪的陰性樣品適量，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照樣品溶液。

4.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL，測(cè)定。陰性對(duì)照溶液在黃芪甲苷對(duì)照品相同保留時(shí)間位置上未見(jiàn)色譜峰，且與相鄰色譜峰分離度大于1.5，說(shuō)明陰性無(wú)干擾。見(jiàn)圖3。

圖3 高效液相色譜圖A.對(duì)照品 B.供試品 C.缺黃芪陰性供試品 1.黃芪甲苷Fig.3 HPLC chromatogramsA.reference substance B.sample C.negative sample without Astragali Radix 1.astragaloside IV

4.6 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液4、8、12、16、20 μL，進(jìn)樣，以對(duì)照品進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)、峰面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 lnA=1.570 0lnC+12.263 3，r=0.999 9(n=5)。結(jié)果表明黃芪甲苷進(jìn)樣量在1.52～7.60 μg范圍內(nèi)的對(duì)數(shù)值與峰面積的對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。

4.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，黃芪甲苷峰面積的RSD為0.92%(n=6)。表明儀器精密度良好。

4.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、1、3、6、8、10 h 進(jìn)樣，黃芪甲苷峰面積的 RSD 為0.73%(n=6)。表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品6份，照供試品溶液制備方法，測(cè)定，黃芪甲苷含量 RSD為1.02%(n=6)，表明本試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

4.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)定的同批樣品6份，分別精密加入黃芪甲苷對(duì)照品適量，照供試品溶液制備方法，按確定的色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。

4.11 樣品測(cè)定 稱取供試品5 g，精密稱定，制備供試品溶液，按4.1項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表6。

5 討論

本品的薄層色譜鑒別方法系在同一色譜條件下同時(shí)鑒別三七、黃芪成分，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道;本方法均以陰性樣品為對(duì)照，結(jié)果表明各薄層斑點(diǎn)不受樣品中其他各藥的干擾，專(zhuān)屬性強(qiáng)，簡(jiǎn)單易行，可作為本品定性檢測(cè)指標(biāo)。

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)Tab.5 Results of revovery test(n=6)

表6 樣品測(cè)定結(jié)果 (n=3)Tab.6 Results of sample determination (n=3)

本制劑由三七，黃芪、山藥等藥材提取制成，樣品成分復(fù)雜，含皂苷類(lèi)物質(zhì)較多，采用高效液相色譜法測(cè)定三七中主要成分。對(duì)供試品溶液的提取方法進(jìn)行比較，采用中性氧化鋁吸附法、大孔樹(shù)脂吸附法、水飽和正丁醇萃取法、正丁醇萃取法，試驗(yàn)結(jié)果表明，采用水飽和正丁醇萃取法，后用氨試液洗滌，方法操作簡(jiǎn)便，定量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于本制劑中三七的質(zhì)量控制。

對(duì)制劑中黃芪的有效成分黃芪甲苷測(cè)定，采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，對(duì)樣品的前處理進(jìn)行研究，采用D101型大孔樹(shù)脂純化供試品溶液，并用不同濃度乙醇梯度洗脫，供試品純化效果明顯，經(jīng)方法學(xué)研究結(jié)果表明，本定量測(cè)定方法能夠用于本制劑中黃芪的質(zhì)量控制，為制定本制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù)。

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