窈窕茶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

周 欣， 宋粉云， 鐘兆健， 李健奇

(廣東藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

窈窕茶為香港北京制藥廠提供，是由決明子、枳實、厚樸、陳皮等藥材經(jīng)粉碎后制成的茶包，具有通便散熱結(jié)、利水消腫、理氣健脾的功效，臨床主要用于治療腸胃積熱、水濕內(nèi)停導(dǎo)致的肢體沉重浮腫，大便秘結(jié)、腹脹、腹痛，口干口燥，小便不利等癥狀。該產(chǎn)品尚未見相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)報道，為評價窈窕茶的質(zhì)量，確保臨床療效，本實驗研究建立了決明子、枳實、厚樸的薄層色譜鑒別方法，該方法簡便、可行，重復(fù)性好;其中厚樸具有燥濕消痰、下氣除滿的作用，常用于食積氣滯、腹脹便秘等癥狀的治療［1］，是窈窕茶的重要組成部分，厚樸的主成分為厚樸酚及和厚樸酚，因此通過采用反相高效液相色譜法對其進行定量測定來對該藥進行質(zhì)量控制［2-4］，該法具有分離效果好、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點。

1 儀器和試藥

安捷倫公司生產(chǎn)Agilent 1100高效液相色譜儀，Agilent 1100系列雙元泵，Agilent 1100 nm可變波長檢測器，Agilent 1100/化學(xué)工作站;昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)超聲波清洗器 KQ5200［頻率:(35±5)%KHz;功率:250 W］。

大黃酚對照品(中國藥品生物制品檢定所，0796－200105)，大黃素對照品(中國藥品生物制品檢定所，0795－200205)，辛弗林對照品(中國藥品生物制品檢定所，0727－200105)，厚樸酚對照品(中國藥品生物制品檢定所，110729－200310)，和厚樸酚對照品(中國藥品生物制品檢定所，110730－200609);窈窕茶(香港北京制藥廠，批號:I0509Y、H1201Y、I0620Y)，規(guī)格為2 g/包;水為雙蒸水，甲醇為色譜純，其他化學(xué)試劑均為分析純。

2 定性鑒別

2.1 決明子的鑒別 取窈窕茶內(nèi)容物10 g于100 mL具塞錐形瓶中，加入20%鹽酸溶液(37%濃鹽酸溶液約27 mL配成50 mL溶液)，超聲30 min，濾過，用三氯甲烷萃取2次，每次20 mL;合并三氯甲烷層后濃縮至3～5 mL，作為供試品溶液;按此法制得3份不同批號供試品溶液。取大黃酚、大黃素對照品適量，加甲醇配成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作為對照品溶液。按處方從中除去決明子，依法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄VIB)試驗，吸取3個批號供試液和陰性溶液各10 μL，對照品溶液5 μL;分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)-正己烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶14∶5 ∶0.1)為展開劑，展開，取出后晾干。置365 nm紫外光燈下檢視。供試品色譜中在與對照品相應(yīng)的位置上顯相同黃色熒光斑點，陰性對照無干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 決明子薄層色譜圖1.陰性對照 2.大黃酚和大黃素對照品3-5.樣品(I0509Y，I0620Y，H1201Y)Fig.1 TLC of Cassiae Semen1.negative sample without Cassiae Semen 2.reference substances of emodin and chrysophanol 3-5.samples(I0509Y，I0620Y，H1201Y)

2.2 枳實的鑒別 取窈窕茶內(nèi)容物4 g于100 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇40 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液;按此法制得3份不同批號的供試品溶液。取辛弗林對照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按處方從中除去枳實，依法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄VIB)試驗，吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲醇-丙酮-三氯甲烷-濃氨水(3∶4 ∶13 ∶0.5)為展開劑，展開，取出后晾干，噴以0.5%茚三酮乙醇顯色，在105℃加熱約10 min至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紅色斑點，陰性對照無干擾。結(jié)果見圖2。

2.3 厚樸的鑒別 取窈窕茶10 g于100 mL具塞錐形瓶中，加甲醇100 mL，密塞，靜置過夜，超聲30 min，濾過，取一半濾液水浴蒸干，殘渣用1～2 mL甲醇溶解作為供試品溶液;按此法制得3份不同批號的供試品溶液。取厚樸酚及和厚樸酚對照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作為對照品溶液。按處方從中除去厚樸，依法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄VIB)試驗，吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲酸(17∶3∶0.4)為展開劑，展開，取出后晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，105℃加熱至斑點清晰。供試品色譜中在與對照品相應(yīng)的位置顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。結(jié)果見圖3。

圖2 枳實的薄層色譜圖1-3.樣品(I0509Y，I0620Y，H1201Y)4.辛弗林對照品 5.陰性對照Fig.2 TLC of Aurantii Fructus immaturus1-3.sample(I0509Y，I0620Y，H1201Y)4.reference substance of synephrine 5.negative sample without Aurantii Fructus immaturus

圖3 窈窕茶中厚樸的薄層色譜圖1-3.樣品(I0509Y，I0620Y，H1201Y)4.厚樸酚及和厚樸酚對照品 5.陰性對照Fig.3 TLC of Magnoliae officinalis Cortex1-3.samples(I0509Y，I0620Y，H1201Y)4.reference substance of magnolol and honokio 5.negative sample without Magnoliae officinalis Cortex

3 樣品測定

3.1 樣品制備

3.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取厚樸酚對照品11.1 mg置于50 mL量瓶中，和厚樸酚對照品10.0 mg置于100 mL量瓶中，分別加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液，含厚樸酚為222 μg/mL，和厚樸酚為 100 μg/mL。

圖4 厚樸酚及和厚樸酚高效液相色譜圖A.混合對照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對照溶液 1.和厚樸酚 2.厚樸酚Fig.4 HPLC chromatogramsA.mixed reference substances B.sample C.negative sample 1.honokio 2.magnolol

3.1.2 供試品溶液的制備 取本品裝量差異項下的內(nèi)容物混勻，取約10 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，靜置過夜，超聲處理20 min，放冷，用甲醇補足失重，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

3.1.3 陰性對照液的制備 按處方從中除去厚樸，照3.1.2項下的制備方法處理得陰性對照溶液。

3.2 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 色譜柱為 DiamonsidTM-C18柱(迪馬公司，250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相甲醇-0.3%磷酸(68∶32);體積流量1.0 mL/min;檢測波長294 nm;柱溫30℃。分別取混合對照品溶液(含厚樸酚為77.7 μg/mL、和厚樸酚為30.0 μg/mL)、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL注入液相色譜儀，理論塔板數(shù)以厚樸酚峰計算應(yīng)不低于15 000，厚樸酚、和厚樸酚的拖尾因子為0.98、1.00;厚樸酚、和厚樸酚與其它組分的分離度都大于1.5;陰性對照不干擾樣品測定。結(jié)果見圖4。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 分別吸取一定量的厚樸酚、和厚樸酚對照品貯備液，混合，加甲醇稀釋成厚樸酚質(zhì)量濃度為 44.4、55.5、66.6、77.7、88.8、99.9、111.0 μg/mL，和厚樸酚質(zhì)量濃度為 15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0 μg/mL 的溶液。依次進樣10 μL，每個濃度測定3次以上。以峰面積(A)及對照品溶液系列濃度(C)進行回歸，得厚樸酚回歸方程A=12.18C－26.55，相關(guān)系數(shù)r=0.999 3;和厚樸酚回歸方程為A=13.98C－4.63，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1。表明厚樸酚質(zhì)量濃度在 44.4 ～ 111.0 μg/mL 之間、和厚樸酚質(zhì)量濃度在 15.0 ～45.0 μg/mL之間與峰面積線性關(guān)系良好。

3.3.2 精密度試驗 取厚樸酚質(zhì)量濃度為77.7 μg/mL、和厚樸酚為30.0 μg/mL的混合對照品溶液10 μL連續(xù)進樣，測定5次，RSD分別為1.28%和1.52%，表明儀器精密度良好。

3.3.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液(批號I0509Y)在0、2、4、6、8、12 h 分別進樣 10 μL，RSD 分別為0.95%和1.24%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。3.3.4 重復(fù)性試驗 取同一批號(批號I0509Y)樣品6份，按3.1.2項下的制備方法處理、分別測定3次，結(jié)果厚樸酚平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.88 mg/g，RSD為1.83%;和厚樸酚平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.33 mg/g，RSD為2.30%，表明分析方法重復(fù)性良好。

3.3.5 加樣回收試驗 精密稱取窈窕茶樣品(批號I0509Y)共6份，加入相應(yīng)量的厚樸酚、和厚樸酚對照品，按3.1.2項下的制備方法處理并測定，計算回收率。厚樸酚平均回收率為 99.2%，RSD為1.53%;和厚樸酚平均回收率為 96.2%，RSD為1.49%，表明本方法準(zhǔn)確可靠，見表1、2。

表1 厚樸酚回收率試驗結(jié)果 (n=6)Tab.1 Recovery test results of magnolol(n=6)

表2 和厚樸酚回收率試驗結(jié)果 (n=6)Tab.2 Recovery test results of honokio (n=6)

3.4 樣品測定 取窈窕茶3個不同批號樣品(平均裝量 I0509Y 為2.29 g/袋、H1201Y 為2.24 g/袋、I06620Y 為2.24 g/袋)，按 3.1.2 項下的制備方法處理后測定，得厚樸酚及和厚樸酚的量，結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果 (n=3)Tab.3 Determination results of samples (n=6)

4 討論

4.1 決明子的薄層鑒別中，提取過程將提取和水解［1］兩步結(jié)合在一起，改用超聲30 min的方法;并且萃取后對三氯甲烷層進行濃縮而不是蒸干，確保了溶液成分的完整和穩(wěn)定。薄層展開中以石油醚(30～60℃)-正己烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶14∶5∶0.1)為展開劑［5］，使用硅膠 G 板和 H 板展開，均能看到斑點，但用G板展開速度明顯快于H板，且薄層斑點效果更清晰。

4.2 枳實的薄層鑒別中，以甲醇-丙酮-三氯甲烷-濃氨水(3∶4∶13 ∶0.5)為展開劑［6-7］，直接點于硅膠G薄層板，噴以0.5%茚三酮乙醇顯色，相較于中國藥典中采用1%氫氧化鈉堿性硅膠G板［1］，薄層結(jié)果更清晰易見。

4.3 厚樸的薄層鑒別中，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲酸(17 ∶3 ∶0.4)為展開劑［8］，取代中國藥典中以苯-甲醇(27∶1)為展開劑［1］，避免了溶劑苯的使用，提高了實驗的安全性。

4.4 關(guān)于HPLC流動相的選擇，流動相曾直接采用甲醇-水［9］，譜圖中色譜峰的對稱性都較差，后嘗試采用加入 0.1% ～0.3%的磷酸［10-11］，結(jié)果顯示加入0.3%的磷酸時，色譜峰對稱性最好;考察流動相甲醇-0.3%磷酸的不同配比，結(jié)果顯示，選用甲醇-0.3%磷酸(68∶32)為流動相時，色譜峰分離效果最好，分離度都大于1.5，理論塔板數(shù)不低于15 000。

4.5 關(guān)于陰性色譜圖中12 min和19 min出現(xiàn)的比樣品中大的譜峰是因為在陰性對照的制備中使用的藥材與窈窕茶樣品使用藥材并非同一批號，由于不同規(guī)格、產(chǎn)地、生長環(huán)境、采收時間都可能影響藥材中有效成分的量，所以造成在此處某一藥材的成分量偏高，峰面積較樣品突出的原因。從整個譜圖看，此兩峰并未對本實驗研究的厚樸酚及和厚樸酚的定量測定造成影響。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:135，230，235.

［2］干國平，熊 麗，陸海濤，等.高效液相色譜法測定香砂養(yǎng)胃丸中厚樸酚與和厚樸酚含量［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2002，22(12):734-735.

［3］蔣 平，王文清，王 晨，等.RP-HPLC測定開胸順氣滴丸中厚樸酚與和厚樸酚含量［J］.華西藥學(xué)雜志，2006，21(6):577-579.

［4］張方杰，李 軻.中華肝靈膠囊中厚樸酚與和厚樸酚含量測定的研究［J］.當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2008，149:43-44.

［5］高保拴，聶麗萍.近視靈口服液中決明子的TLC鑒別［J］.河北省科學(xué)報，1996，1(1):38-40.

［6］李琦智，曾 安，朱 敏，等.枳實消食膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.職業(yè)衛(wèi)生與病傷，2004，19(1):29-30.

［7］張志紅，劉愛芹，于勝海，等.咳喘寧沖劑的薄層色譜鑒別［J］.齊魯藥事，2005，24(5):288-289.

［8］張 俊.清肝利膽膠囊的薄層色譜鑒別法［J］.江蘇藥學(xué)與臨床研究，2004，12(2):20-21.

［9］邱蔚芬，鄒玉繁.HPLC測定保嬰丹中厚樸酚及和厚樸酚含量［J］.食品與藥品，2007，9(1):24-25.

［10］鐘小群，蔡慶順，李玉云，等.HPLC測定藿香正氣膠丸厚樸酚及和厚樸酚含量［J］.中成藥，2006，28(2):288-290.

［11］謝友良，曾惠芳，林 吉，等.HPLC測定黃芩正氣膠囊中橙皮苷、黃芩苷、和厚樸酚、厚樸酚的含量［J］.中成藥，2006，28(1):34-35.