高效液相法快速測定紫金砂中沒藥烷吉酮和異歐前胡素的含量

王曉梅， 汪鋆植， 郭志勇， 彭元莉， 鄒 坤， 但飛君

(天然產(chǎn)物開發(fā)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(三峽大學(xué))，三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)院，湖北宜昌 443002)

紫金砂來源于傘形科當(dāng)歸屬植物拐芹Angelica polymorphaMaxim.的根［1］，為土家族常用藥物，為《湖北中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2009年版)收載品種，具有溫中散寒、理氣止痛的功效，用于治療胃痛、腹痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛等。紫金砂主要含有異歐前胡素﹙isoimperatorin ﹚、歐前胡素［4］(imperatorin)等香豆素成分，沒藥烷吉酮［6］(Bisabolangelone)等萜類成分［7-9］，還有甾醇類成分［2-3］，揮發(fā)油等［5］。其中沒藥烷吉酮是其主要抗?jié)兓钚猿煞郑?-10］，歐前胡素和異歐前胡素具有抗菌、抗腫瘤等多種藥理作用［13］，歐前胡素主要用于抗菌，抗癲癇等作用［10-12］，本試驗(yàn)對紫金砂中主要成分和主要活性成分異歐前胡素和沒藥烷吉酮的含量進(jìn)行了測定。1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑 藥材采購于鄂西不同的地區(qū)。經(jīng)中南民族大學(xué)萬定榮教授鑒定為傘形科植物拐芹Angelica polymorphaMaxim.的根。

甲醇、乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)。沒藥烷吉酮對照品(本實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)HPLC分析其純度均大于98%)、異歐前胡素對照品(本實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)HPLC分析其純度均大于98%)。

1.2 儀器 高效液相色譜儀prostar 210，AL204電子天平，紫外-可見分光光度計(jì) U-3010，KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件的優(yōu)選 分別取紫金砂沒藥烷基酮和異歐前胡素的對照品和樣品經(jīng)甲醇溶解后，紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長掃描，圖譜顯示2個對照品和樣品在226 nm處均有最大吸收，故選擇226 nm為檢測波長。

2.2 色譜條件 色譜柱為YMC-Pack AQ C18，150 mm ×4.6 mm，5 μm;流動相為乙腈-水(40 ∶60 ～70 ∶30);進(jìn)樣量為20 μL，流速為1.0 mL/min;柱溫為25℃，檢測波長為226 nm。在該色譜條件下待測組分可達(dá)到基線分離見下圖1。

圖1 紫金砂的HPLC圖Fig.1 HPLC of Angelica polymorpha Maxim

2.3 對照品溶液制備 精密稱取沒藥烷吉酮和異歐前胡素對照品各10 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋到刻度，0.45 μL濾膜過濾，供測定用。

2.4 供試樣品溶液制備 取藥材粉碎，過80目篩，精確稱取粉末1 g置于錐形瓶中，精密量取甲醇20 mL浸泡2 h，40℃時超聲波(40 W)超聲提取15 min，放冷，加甲醇至原重量，0.45 μL濾膜過濾，供測定用。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液 1、3、5、7、9 μL 注入液相色譜儀，按色譜條件測得峰面積，以進(jìn)樣量(μL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為:沒藥烷基酮Y=6.541 49×107X－1.913 47 ×106，r=0.999 81，在1～9 mg/mL呈良好的線性關(guān)系。異歐前胡素Y=3.273 98×107X－1.421 15 ×107，r=0.999 93，在1～9 mg/mL呈良好的線性關(guān)系。圖2和圖3為沒藥烷基酮和異歐前胡素對照品溶液的HPLC圖。

圖2 對照品沒藥烷基酮的HPLC圖Fig.2 HPLC of bisabolangelone

圖3 對照品異歐前胡素的HPLC圖Fig.3 HPLC of isoimperatorin

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品溶液，間隔3 h測1次，共測24 h。結(jié)果沒藥烷吉酮峰面積RSD為1.3%(n=8)，異歐前胡素峰面積RSD為1.14%(n=8)表明供試品溶液室溫下放置24 h基木穩(wěn)定。

2.7 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取沒藥烷吉酮和異歐前胡素對照品溶液6 μL重復(fù)進(jìn)樣5次，測定沒藥烷基酮峰面積的RSD為1.48%，異歐前胡素峰面積的RSD為0.77%

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品5份，照2.4項(xiàng)操作，測得沒藥烷吉酮平均含量為3.8%;異歐前胡素的平均含量為3.1%。

2.9 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量樣品3份，加入與樣品含量相當(dāng)?shù)膶φ掌?，測定沒藥烷吉酮和異歐前胡素含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1，表2。

表1 沒藥烷吉酮加樣回收率(n=5)Tab.1 The recoveries of bisabolangelone

2.10 樣品含量測定 收集不同產(chǎn)地的5批樣品，分別測定藥材中沒藥烷吉酮和異歐前胡素的含量。取藥材粉碎，過80目篩，精確稱取粉末1 g，精密量取甲醇20 mL浸泡2 h，40℃時超聲波(40 W)超聲提取15 min，放冷，加甲醇至原重量。0.45 μL濾膜過濾，供測定用。按上述色譜條件，進(jìn)樣測定。結(jié)果見表3。

表2 異歐前胡素加樣回收率(n=5)Tab.2 The recoveries of isoimperatorin(n=5)

表3 不同產(chǎn)地的紫金砂沒藥烷基酮和異歐前胡素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.3 The concentration of bisabolangelone and isoimperatorin of Angelia polymorpha Maxim in different habitats

3 討論

紫金砂為土家族治療胃腸疾病的常用藥物。本實(shí)驗(yàn)從紫金砂主產(chǎn)地鄂西不同的地方收集了具有代表性藥材，用HPLC建立了沒藥烷吉酮和異歐前胡素的含量測定方法。為制定紫金砂的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步控制紫金砂的質(zhì)量提供了基礎(chǔ)。

波長分別取紫金砂沒藥烷基酮和異歐前胡素的對照品和樣品經(jīng)甲醇溶解后，紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長掃描，圖譜顯示2個對照品和樣品在226 nm處均有最大吸收，故選擇226 nm為檢測波長。比較了不同系統(tǒng)和流動相比例，如甲醇-水、乙腈-水-磷酸，甲醇-水-磷酸等，效果都不理想。乙腈-水的比例經(jīng)調(diào)試，結(jié)果40∶60～70∶30的比例兩者在樣品中可以得到較好的分離，且保留時間合適，檢測比較快。因此，選擇乙腈-水作為流動相。通過正交實(shí)驗(yàn)確定其超聲時間，藥材浸泡的時間，最后得出浸泡2 h，超聲15 min，可使紫金砂藥材中的2種有效成分含量達(dá)到最高。

實(shí)驗(yàn)表明沒藥烷吉酮在紫金砂中含量較高，平均達(dá)3.3%，同時沒藥烷吉酮是紫金砂中抗?jié)兊闹饕行С煞?，但不同產(chǎn)地的紫金砂中沒藥烷吉酮含量差異較大，因此，建立沒藥烷吉酮的含量測定方法，對紫金砂中沒藥烷吉酮的含量進(jìn)行測定，對控制紫金砂的質(zhì)量具有重要意義。實(shí)驗(yàn)表明，以根粗大，油性強(qiáng)，斷面擠壓有油性物滲出者含量高。

沒藥烷吉酮、異歐前胡素沸點(diǎn)低，均具有一定揮發(fā)性。經(jīng)過對放置于不同狀態(tài)，不同時間的紫金砂的含量進(jìn)行測定，如下表4結(jié)果表明，紫金砂存放時間過長或不當(dāng)，沒藥烷吉酮、異歐前胡素的含量會下降，影響藥效。因此，存儲一般不宜超過2年，應(yīng)密閉保存，避免高溫和酸堿。

表4 放置不同時間的紫金砂沒藥烷基酮和異歐前胡素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.4 The concentration of bisabolangelone and isoimperatorin of Angelia polymorpha Maxim stored for different periods of time

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