正交法優(yōu)選炒菟絲子的最佳炮制工藝

徐 鑫， 張學(xué)蘭， 唐 超

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355)

菟絲子為旋花科植物菟絲子南方菟絲子Cuscuta australisR.Br.或菟絲子Cuscuta chinensisLam.的干燥成熟種子，具有滋補(bǔ)肝腎，固精縮尿，安胎，明目，止瀉等作用，臨床上常用于肝腎不足，腰膝酸軟，陽(yáng)痿遺精，遺尿尿頻，腎虛胎漏等的治療［1］。現(xiàn)代文獻(xiàn)研究表明，菟絲子的化學(xué)成分主要含有黃酮類(lèi)、甾類(lèi)化合物、多糖、微量元素及氨基酸等［2－4］。藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，菟絲子中黃酮類(lèi)特征成分金絲桃苷是菟絲子的主要活性成分，具有保護(hù)肝組織和增強(qiáng)免疫等作用［5］。目前中國(guó)藥典收載的菟絲子規(guī)格為菟絲子和鹽菟絲子，炒菟絲子作為傳統(tǒng)的炮制規(guī)格，目前還缺乏深入而系統(tǒng)的研究，本實(shí)驗(yàn)研究了清炒菟絲子的客觀工藝技術(shù)參數(shù)，為炒菟絲子飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和炮制機(jī)理研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

菟絲子藥材，產(chǎn)地山東，購(gòu)自亳州成源中藥飲片有限公司(批號(hào):20090501)，經(jīng)周鳳琴教授鑒定為旋花科植物菟絲子Cuscuta chinensisLam.的干燥成熟種子。

多星電炒鍋(淄博多星電器集團(tuán)有限責(zé)任公司);PM PLUS型紅外測(cè)溫儀(美國(guó)Raytek公司);KQ－250E型醫(yī)用超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司);LDZ4－0.8型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);1100型高效液相色譜儀、工作站及紫外檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司)。

金絲桃苷對(duì)照品(批號(hào):111521－200303)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;高效液相用乙腈為色譜純;濰坊娃哈哈飲料有限公司純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 清炒工藝的設(shè)計(jì) 炒制溫度和炒制時(shí)間對(duì)藥材質(zhì)量影響較大，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，因素與水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)安排見(jiàn)表2，進(jìn)行工藝優(yōu)選。

表1 因素與水平

2.2 樣品的制備 藥材的投藥量為50 g，取9份，按正交設(shè)計(jì)表的組合，用紅外測(cè)溫儀測(cè)定鍋底溫度，進(jìn)行炒制，各樣品性狀及成品得率見(jiàn)表3。

2.3 含水量的測(cè)定 取2.2項(xiàng)下的各樣品(過(guò)2號(hào)篩)約2.5g，精密稱定，按《中國(guó)藥典》2010版一部附錄項(xiàng)下的烘干法測(cè)定，9份樣品的含水量為1.42% ～4.76%，樣品中各指標(biāo)成分的含量以干燥品計(jì)算。

2.4 HPLC法測(cè)定金絲桃苷含量［1］

2.4.1 色譜條件 KromasiL C18色譜柱;以乙腈－0.1%磷酸水(17∶83)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min;柱溫為30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm;參比波長(zhǎng)為400 nm;進(jìn)樣量為20 μL。

2.4.2 對(duì)照液的制備 取金絲桃苷對(duì)照品20.24 mg，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋至25 mL量瓶中，得到對(duì)照液貯備液，備用，并依次精密吸取金絲桃苷對(duì)照液貯備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照液。

表2正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 菟絲子樣品性狀及成品得率

2.4.3 供試液的制備 取菟絲子各炒品過(guò)4號(hào)篩粉末約1 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加80%甲醇40 mL超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)60 min，放冷，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，微孔濾膜濾過(guò)，作為供試液。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用2.4.2項(xiàng)中的對(duì)照品溶液，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定以峰面積Y對(duì)金絲桃苷濃度X進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=23.652X－4.794 6(R=0.999 6)。實(shí)驗(yàn)表明，金絲桃苷濃度在0.016 2～0.097 2 mg/mL范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 取4號(hào)供試品溶液，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，金絲桃苷峰面積的RSD為0.49%。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取4號(hào)供試液，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件分別于 0、2、4、6、8、12 h 時(shí)進(jìn)樣，金絲桃苷峰面積的 RSD為0.99%，可見(jiàn)在12 h內(nèi)供試液穩(wěn)定。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取4號(hào)樣品，平行制備6份供試液，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，RSD為1.43%，可見(jiàn)方法重現(xiàn)性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知金絲桃苷含量的4號(hào)樣品約1 g，精密稱定，共稱取6份，分別置50 mL量瓶中，各加入金絲桃苷對(duì)照品溶液(0.809 6 mg/mL)6 mL，再按2.4.3項(xiàng)方法制備，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，依法測(cè)定，結(jié)果其平均回收率為96.38%，RSD為1.46%，見(jiàn)表4。

表4 回收率測(cè)定結(jié)果

2.4.9 供試品含量測(cè)定 取金絲桃苷對(duì)照液與供試液按2.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，依法測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1，含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1金絲桃苷對(duì)照品(A)、2號(hào)樣品(B)HPLC圖

2.5 水溶性浸出物含量測(cè)定 取過(guò)2號(hào)篩的各樣品粉末約2 g，精密稱定，置250 mL錐形瓶中，分別精密加水100 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，保持微沸回流1 h，放冷后，取下錐形瓶，密塞，稱定重量，補(bǔ)足失重，搖勻，離心(3 000 r/min，20 min)，精密量取續(xù)濾液25 mL至已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.6 最佳炮制工藝條件的優(yōu)選 以炮制品中金絲桃苷(測(cè)定方法見(jiàn)2.4.9項(xiàng)，n=3)、水溶性浸出物含量(測(cè)定方法見(jiàn)2.5項(xiàng)，n=3)為指標(biāo)，利用綜合加權(quán)評(píng)分法確定最佳的炮制方法。具體權(quán)重為:金絲桃苷的含量占70%，水溶性浸出物含量占30%。各項(xiàng)試驗(yàn)指標(biāo)得分相加求出綜合評(píng)價(jià)值，以綜合評(píng)價(jià)值對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表5，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2結(jié)果可以看出，170℃炒制5 min為菟絲子清炒的最佳工藝。因素C，D為空白項(xiàng)，所以，選擇C，D列合并為誤差列。由表6方差分析結(jié)果可以看出，炒制溫度是影響菟絲子飲片質(zhì)量的主要因素，炒制時(shí)間沒(méi)有顯著性。

表5 各指標(biāo)成分含量的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表6 方差分析

3 小結(jié)與討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)在對(duì)菟絲子炮制歷史沿革和現(xiàn)代文獻(xiàn)分析的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，選取金絲桃苷和水溶性浸物含量作指標(biāo)，以炒制溫度和炒制時(shí)間作考察因素，優(yōu)選出了炒菟絲子的炮制工藝，結(jié)果其最佳工藝為170℃炒制5 min。最佳工藝所炮制出的樣品，表面棕黃色，微有裂口，略有香氣。炒制溫度是影響菟絲子質(zhì)量的主要因素。

3.2 菟絲子為臨床常用的補(bǔ)腎類(lèi)中藥，其質(zhì)地堅(jiān)硬，傳統(tǒng)認(rèn)為，菟絲子炒后可提高煎出效果，便于粉碎，利于制劑［6］。按本實(shí)驗(yàn)相關(guān)方法測(cè)定菟絲子生品和最佳工藝炒制品中水溶性浸出物和金絲桃苷含量，結(jié)果表明水溶性浸出物和金絲桃苷含量均有增加，說(shuō)明菟絲子炒制后確實(shí)利于其藥效成分的溶出。但炒制溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，金絲桃苷含量明顯降低，提示炒制溫度要適中。

3.3 菟絲子含黏液質(zhì)較多，在按藥典附錄法測(cè)定樣品中水溶性浸出物含量時(shí)樣品難于過(guò)濾，所以本實(shí)驗(yàn)采用離心法去除雜質(zhì)。

［1］中國(guó)藥典［S］. 一部.2010:290－291.

［2］郭 澄，王雅君，張劍萍，等.菟絲子的化學(xué)成分和藥理活性研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2005，16(10):1035－1036.

［3］葉 敏，閻玉凝，喬 梁，等.中藥菟絲子化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2002，27(2):115－117.

［4］林慧彬，林建強(qiáng)，林建群，等.山東4種菟絲子微量元素的比較研究［J］.山東中醫(yī)雜志，2002，21(2):105－106.

［5］李敏芳，李 慧，王學(xué)美.金絲桃苷藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2008，15(4):102－104.

［6］龔千鋒.中藥炮制學(xué)［M］.北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2003:226.