當(dāng)歸四逆湯中阿魏酸在大鼠血清中含量測(cè)定及藥動(dòng)學(xué)研究

高宇勤， 趙國(guó)平*， 江仁望

(1.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院2.暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州 510632)

當(dāng)歸四逆湯出自《傷寒論》，由當(dāng)歸、白芍、桂枝、細(xì)辛、甘草、通草、大棗等7味藥組成。該方溫經(jīng)散寒、養(yǎng)血通脈，具有擴(kuò)張血管，改善微循環(huán)，降低血液黏稠度［1］，抗凝、抗炎、鎮(zhèn)痛［2］，改善心肌血氧供應(yīng)［3］等作用。臨床主要用于血虛寒厥證，治療雷諾氏?。?］、冠心?。?］、糖尿病下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥［6］等。有報(bào)道證實(shí)在該方乙醇提取液中含有阿魏酸［7］，而阿魏酸具有強(qiáng)抗氧化能力及清除自由基作用［8－11］，對(duì)于冠心病和一部分癌癥有治療作用［12－15］，可能是當(dāng)歸四逆湯治療作用的其中一個(gè)重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。但在當(dāng)歸四逆湯水煎劑中是否存在阿魏酸，該方口服后血清中是否也含有阿魏酸，經(jīng)當(dāng)歸四逆湯配伍應(yīng)用后阿魏酸的血液動(dòng)力學(xué)有何改變，均值得探討。為此，本實(shí)驗(yàn)探究當(dāng)歸四逆湯水煎劑中是否也含有阿魏酸及當(dāng)歸四逆湯水煎劑大鼠灌胃后其中成分阿魏酸是否入血及其藥代動(dòng)力學(xué)規(guī)律。

1 儀器與實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

Agilengt 1200高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent)，RE－52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，BS110型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

甲醇、乙腈均為色譜純，正丁醇，冰醋酸為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為三重蒸餾水，阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):ZL20090425AWS)購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，當(dāng)歸四逆湯(當(dāng)歸、白芍、桂枝、細(xì)辛、甘草、通草、大棗等按4∶3∶3∶1∶2∶2∶1比例混合)藥物飲片購(gòu)自廣東中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。當(dāng)歸四逆湯按照中藥煎藥常規(guī)煎，經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)濃縮成每毫升相當(dāng)于1 g生藥的混懸液。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，250～300 g，♀♂各半，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及含藥血清的收集

42只SD大鼠，隨機(jī)分成7組，灌胃后 30、60、90、120、180、360、540 min 共 7 個(gè)時(shí)間點(diǎn)腹主動(dòng)脈取血，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)為一組，每組6只，♀♂各半，于灌胃前一天晚上禁食，飲水不限。按20 g/kg灌胃給予當(dāng)歸四逆湯水煎液，具體方法:腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉動(dòng)物，每只大鼠開腹，于腹主動(dòng)脈取血5～6 mL，置于離心管內(nèi)，靜置1 h，離心(4 000 r/min，15 min，6℃)，棄去沉淀，取上清液 2 mL，加正丁醇 8 mL，混勻 3 min，加乙酸 20 μL，離心4 000 r/min，25 min，4 ～6℃，取上清液于尖底離心管中40℃水浴，氮?dú)獯蹈桑? mL甲醇定容，并微孔濾膜過(guò)濾，10 μL 進(jìn)樣。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品配制

利用二甲基亞砜溶解阿魏酸，并配成50 mmol/L貯備液，從標(biāo)準(zhǔn)貯備液中取阿魏酸，取4個(gè)濃度點(diǎn)(2 × 10－5、4 × 10－5、2 × 10－5，8 × 10－5，16 × 10－5mol/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，上述標(biāo)準(zhǔn)品加空白血清2 mL，加正丁醇 8 mL，混均 3 min，加乙酸 20 μL，離心4 000 r/min，25 min，4 ～6℃，取上清液于尖底離心管中40℃水浴氮?dú)獯蹈桑? mL甲醇定容，并微孔濾膜過(guò)濾，10 μL 進(jìn)樣。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照HPLC圖譜

2.3 色譜條件

色譜柱:Capcell PAK C18size 250 mm×4.6 mm，TYPE MGⅡ5 μm，柱溫20℃。梯度洗脫見表1，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)有230 nm、275 nm、254 nm、320 nm，進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序

3結(jié)果

當(dāng)歸四逆湯水煎劑經(jīng)正丁醇萃取后，經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm圖譜上存在阿魏酸峰，按前述樣品處理方法處理標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)HPLC測(cè)定(見圖1)標(biāo)準(zhǔn)品阿魏酸面積(Y)并計(jì)算Y對(duì)阿魏酸血藥濃度之間的回歸方程，方程為Y=5.141+3.62X，r=0.998 7，P＜0.01(Y為阿魏酸峰面積，X為阿魏酸濃度，單位為10－5mol/L)，樣品及空白血清經(jīng)上述方法處理，經(jīng)HPLC測(cè)定，圖譜見(圖2、3)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出樣品中的阿魏酸的濃度結(jié)果，見表2，并繪制出阿魏酸濃度對(duì)于時(shí)間的曲線，見圖4，上述濃度數(shù)據(jù)使用藥代動(dòng)力學(xué)計(jì)算程序(3P97)進(jìn)行曲線擬合，得出大鼠口服當(dāng)歸四逆湯后，其有效成分阿魏酸的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表3，統(tǒng)計(jì)矩結(jié)果見表4，結(jié)果表明當(dāng)歸四逆湯口服后，其中阿魏酸有效成分在大鼠體內(nèi)的藥時(shí)過(guò)程符合一室模型(根據(jù)最小AIC準(zhǔn)則)權(quán)重1/C2，Cmax 7.988 771 mg/L，AUC 7861.507 80 mg/(L·min)，總體表現(xiàn)為口服后吸收快，消除慢。

圖2 血清樣品HPLC圖譜

表2 口服當(dāng)歸四逆湯后阿魏酸在大鼠體內(nèi)的藥-時(shí)曲線(±s)

表2 口服當(dāng)歸四逆湯后阿魏酸在大鼠體內(nèi)的藥-時(shí)曲線(±s)

30 min 60 min 90 min 120 min 180 min 360 min 540 min阿魏酸/(mg/L) 5.7±0.52 6.80±1.90 7.60±0.43 7.80±0.98 8.31±1.17 6.99±0.93 4.98±0.50

圖3 空白血清HPLC圖譜

圖4 口服當(dāng)歸四逆湯后阿魏酸血清濃度對(duì)時(shí)間的關(guān)系

表3 大鼠口服當(dāng)歸四逆湯后血清阿魏酸的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表4大鼠口服當(dāng)歸四逆湯后血清阿魏酸的統(tǒng)計(jì)矩結(jié)果

4 討論

阿魏酸具有抗氧化和抗自由基活性［8－11］，當(dāng)歸四逆湯乙醇提取液含有阿魏酸［7］，但是該方水煎劑是否還含有阿魏酸尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的阿魏酸的高效液相色譜梯度洗脫程序［7］最后采取了表1程序，通過(guò)高效液相色譜(HPLC)首次發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸四逆湯水煎劑在320 nm波長(zhǎng)的圖譜上含有阿魏酸(有研究發(fā)現(xiàn)320nm波長(zhǎng)比較適合阿魏酸檢測(cè)［16］，試驗(yàn)中證實(shí)了這一點(diǎn))而且口服當(dāng)歸四逆湯水煎劑后大鼠血清中也存在阿魏酸，說(shuō)明阿魏酸應(yīng)是當(dāng)歸四逆湯的一個(gè)有效成分，

阿魏酸單體及當(dāng)歸、川芎等單味藥中的阿魏酸在不同動(dòng)物及人體的藥動(dòng)學(xué)已有少量報(bào)道［17－19］，多為一室模型，口服給藥后血藥濃度下降迅速，部分復(fù)方中阿魏酸口服后體內(nèi)分布與代謝為二室模型［20］，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)給大鼠口服當(dāng)歸四逆湯后阿魏酸的藥代動(dòng)力學(xué)為Cmax 7.988 771 mg/L，AUC 7 861.507 80 mg/(L·min)，在大鼠體內(nèi)的藥時(shí)過(guò)程符合一室模型(根據(jù)最小AIC準(zhǔn)則)權(quán)重1/C2，口服吸收快，但是消除慢，與文獻(xiàn)報(bào)道有差異［［16－22］。我們分析造成阿魏酸藥代動(dòng)力學(xué)差異的原因可能有以下兩點(diǎn):首先是不同的動(dòng)物對(duì)同一種物質(zhì)代謝不同;其次是不同的處方合劑中多種物質(zhì)相互影響造成，比較我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和已有報(bào)道也說(shuō)明復(fù)方制劑中多種成分可能對(duì)阿魏酸在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程有明顯影響。

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