黃芩素對(duì)大鼠高脂血癥性脂肪肝的防治作用研究

彭 蕾， 顧振綸， 薛仁宇， 狄建彬， 丁 爽， 郭次儀

(1.蘇州中藥研究所，江蘇蘇州 215007;2.蘇州大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，江蘇蘇州 215123)

脂肪性肝病(Fatty liver disease)是常見的彌漫性肝病之一，是由多種原因引起的肝臟脂肪代謝紊亂的一種代謝性疾病，主要是肝細(xì)胞攝取的脂肪增加而氧化減少所致的肝細(xì)胞內(nèi)蓄積脂肪過多的病理狀態(tài)［1］。通常可分為酒精性脂肪性肝病(alcoholic fatty liver disease，AFLD)和非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)。非酒精性脂肪肝是一種無過量飲酒史，而以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪貯積和脂肪變性為特征的臨床病理綜合癥。隨著人類生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的變化，非酒精性脂肪肝的發(fā)病也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。非酒精性脂肪肝病因復(fù)雜，多種病因均能導(dǎo)致其發(fā)生，而其中高脂血癥是最常見的病因之一。高脂血癥是指血漿中的TC或(和)TG水平升高，使脂質(zhì)代謝紊亂的一種常見病。高脂血癥是形成脂肪肝的基礎(chǔ)，而肝臟的脂肪病變又影響脂質(zhì)代謝，從而加重高脂血癥形成惡性循環(huán)。高脂血癥性脂肪肝如果沒有得到及時(shí)的治療很可能逐漸發(fā)展為脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化、末期肝衰竭以及肝癌［2］。高脂血癥性脂肪肝發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，目前尚缺乏理想的治療藥物。因此，積極尋找高效、安全、廉價(jià)的治療藥物越來越受到關(guān)注。

黃芩素是從唇形科(Labiatae)黃芩屬(Scutellaria)多年生草本植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根部提取出來的有效成分之一，其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于黃酮類。研究表明黃芩素具有降低腦血管阻力、改善腦血循環(huán)、增加腦血流量及抗血小板凝集的作用，且有抗菌、抗病毒、抗炎、保肝利膽、利尿、抗癌等多種藥理作用［3］。此外，黃芩素作為一種有效的自由基清除劑和黃嘌呤氧化酶抑制劑被用于防治心血管疾病［4］。而黃芩素防治高脂血癥性脂肪肝尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過灌服脂肪乳劑法建立大鼠高脂血癥性脂肪肝模型，觀察了黃芩素對(duì)高脂血癥性脂肪肝的防治作用，為黃芩素更廣泛的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，♂性，體重170～190 g，清潔級(jí)，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):XCYK(蘇)2002－0008，使用許可證號(hào):SYXK(蘇)2007－0035。實(shí)驗(yàn)期間飼養(yǎng)室溫度(20±2)℃。

1.2 藥品及主要試劑

黃芩素提取物(其中黃芩素含量≥50%)，由蘇州中藥研究所植化室提供，生產(chǎn)批號(hào):090428;力平之(非諾貝特)膠囊，法國(guó)利博福尼制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào):93405，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào):H20050004，臨用時(shí)用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液(CMC－Na)配成1%藥物濃度。自制豬油;膽固醇，上?？笊锛夹g(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào): 20070712;3號(hào)膽鹽，上?？笊锛夹g(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào):20070816;丙基硫氧嘧啶，蘇州東瑞制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào):080411001;丙二醇和吐溫－80，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)分別為T20061207和F20061016。各指標(biāo)檢測(cè)試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 脂肪乳劑配方

含豬油15%，膽固醇6%，3號(hào)膽鹽2%，丙基硫氧嘧啶0.2%，丙二醇20%，吐溫－80 16%配制而成［5］。

1.4 主要儀器

光學(xué)顯微鏡 CX31，OLYMPUS;分光光度計(jì) T6，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;電熱恒溫水浴鍋HHS－6型，上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠;離心沉淀器80－2型，上海手術(shù)器械廠;內(nèi)切式勻漿機(jī)ZS83－1型，浙西機(jī)械廠;高速冷凍離心機(jī)5417R型，德國(guó)eppendorf公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、造模及給藥方法

將50只SD♂性大鼠，按體重隨機(jī)分成5組，每組10只，依次為正常對(duì)照組(Control)、模型組(Model)、陽(yáng)性藥力平之(Lipanthyl)組 、黃芩素低(25 mg/kg)、高(50 mg/kg)劑量組。各給藥組預(yù)防給藥4 d后，除正常對(duì)照組外，其余每組上午9:00－10:30按時(shí)灌服脂肪乳劑10 mL/(kg·d)，下午2:00－3:00分別按不同劑量以2 mL/(kg·d)體積灌胃，正常組和模型組給與等體積的CMC－Na，連續(xù)給藥4周。于末次給藥后禁食12 h，不禁水，然后以4%水合氯醛10 mL/(kg·d)體重腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，取肝臟稱其濕重計(jì)算肝重系數(shù)，分別用生理鹽水和三氯甲烷－甲醇(1∶1)混合液制成10%肝組織勻漿液，同時(shí)取同一部位肝臟行HE染色作病理組織學(xué)觀察［6］。

2.2 肝重系數(shù)計(jì)算和血清生化指標(biāo)檢測(cè)

肝重系數(shù)=肝重(g)/體重(100 g)。按試劑盒提供的方法分別測(cè)定血清 TC、TG、HDL－C、LDL－C、FFA、ALT和 AST。按下列公式計(jì)算，LDL－C=TC－(TG/2.2+HDL－C)。

2.3 肝臟生化指標(biāo)檢測(cè)

精確稱取大鼠肝組織500 mg，加三氯甲烷－甲醇(1∶1)混合液至5 mL后勻漿，勻漿液置4℃ 24 h后3 500 r/min離心15 min，取上清20 μL置另一試管中，室溫放置12 h以上，待三氯甲烷和甲醇揮發(fā)后，按試劑盒提供的方法分別測(cè)定肝臟中TC和TG含量。在相同部位稱取大鼠肝組織200 mg，加冰生理鹽水2 mL后勻漿，3 500轉(zhuǎn)離心15 min后取上清，按試劑盒方法分別測(cè)定 SOD、MDA和蛋白含量。

2.4 組織學(xué)觀察

取同一部位肝臟以10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，切片，行HE染色。根據(jù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，光鏡檢查脂肪變性程度［7－8］。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 黃芩素對(duì)高脂血癥性脂肪肝大鼠體重、肝重和肝系數(shù)的影響

與正常對(duì)照組相比較，高脂血癥性脂肪肝模型組大鼠肝重和肝系數(shù)升高或明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。連續(xù)給藥4周后，與模型組相比黃芩素各劑量組大鼠肝重和肝系數(shù)明顯降低(P＜0.01)，但陽(yáng)性藥力平之組大鼠肝重和肝系明顯升高數(shù)(P＜0.01)。結(jié)果見表1。

3.2 黃芩素對(duì)高脂血癥性脂肪肝大鼠血脂的影響

與正常對(duì)照組相比較，高脂血癥性脂肪肝模型組大鼠血清TC、TG、FFA和LDL－C升高或明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。連續(xù)給藥4周后，與模型組相比黃芩素各劑量組大鼠血清 TC、TG、LDL－C、FFA的水平降低或明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，黃芩素小劑量對(duì)血清HDL－C也有升高作用(P＜0.05)。陽(yáng)性藥力平之也能降低或明顯降低高脂血癥性脂肪肝大鼠血清TC、TG和FFA含量(P＜0.05或P＜0.01)，但對(duì) LDL－C、HDL－C 未見明顯影響(見表2)。

表1 黃芩素對(duì)高脂血癥性脂肪肝大鼠體重、肝重和肝系數(shù)的影響(x ± s，n=10)

表2 黃芩素對(duì)高脂血癥性脂肪肝大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C和FFA的影響(x ± s，n=10)

3.3 黃芩素對(duì)高脂血癥性脂肪肝大鼠肝功能指標(biāo)的影響

與正常對(duì)照組相比較，高脂血癥性脂肪肝模型組大鼠血清ALT和AST水平升高(P＜0.05)。連續(xù)給藥4周后，與模型組相比黃芩素各劑量大鼠血清ALT和AST降低或明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。但陽(yáng)性藥力平之對(duì)ALT和AST未見有明顯影響(見表3)。

3.4 黃芩素對(duì)高脂血癥性脂肪肝大鼠肝組織中TC、TG、MDA、SOD 的影響

與正常對(duì)照組相比較，高脂血癥性脂肪肝模型組大鼠肝組織中 TC、TG和 MDA明顯增加(P＜0.01)。連續(xù)給藥4周后，與正常對(duì)照組相比黃芩素各劑量組大鼠能明顯降低大鼠肝組織中TC、TG含量(P＜0.01)，明顯升高SOD活性(P＜0.01)。陽(yáng)性藥力平之也能夠明顯降低肝組織中TC、TG含量(P＜0.01)，但對(duì)SOD、MDA無明顯影響(見表4)。

表3 黃芩素對(duì)高脂血癥性脂肪肝大鼠肝功能指標(biāo)的影響(± s，n=10)

表3 黃芩素對(duì)高脂血癥性脂肪肝大鼠肝功能指標(biāo)的影響(± s，n=10)

與正常對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，與模型組比較，*P＜0.05，**P ＜0.01。

組別 劑量/(mg/kg)ALT/(Kar U/L)AST/(Kar U/L)－ 17.26±5.25 56.54±9.42模型組 － 25.43±1.76# 66.95±7.93#力平之組 20 22.83±5.46 58.36±9.72黃芩素組 25 15.06±6.12** 54.44±6.66**50 17.19±3.29* 55.07±8.47正常組*

3.5 黃芩素對(duì)高脂血癥性脂肪肝大鼠肝臟的病理組織學(xué)觀察

大鼠肝臟組織石蠟切片并進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察其病理組織學(xué)變化，結(jié)果表明正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞排列成索狀，結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠肝組織可見彌漫性的脂質(zhì)空泡，并有融合現(xiàn)象，黃芩素各劑量組大鼠給藥四周后，肝細(xì)胞脂質(zhì)變性的程度明顯減輕，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)趨于正常。陽(yáng)性藥力平之對(duì)大鼠肝臟的病理組織學(xué)變化基本上與黃芩素小劑量作用相似，見表5～6。

表4 黃芩素對(duì)高脂血癥性脂肪肝大鼠肝組織中TC、TG、SOD、MDA的影響(x ± s，n=10)

表5 肝臟脂肪變性程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

表6 黃芩素提取物對(duì)高脂血癥性脂肪肝大鼠肝臟的病理組織學(xué)觀察

4 討論

脂肪性肝病是由遺傳－環(huán)境－代謝應(yīng)激相關(guān)因素所致的以肝細(xì)胞脂肪變性為主的臨床病理綜合癥。肝臟在脂類的消化、吸收、分解、合成及運(yùn)輸?shù)冗^程中起著重要作用，是內(nèi)源性血脂和脂蛋白合成及其代謝的主要器官，肝外組織的TC主要由HDL攜帶通過HDL受體途徑進(jìn)入肝臟代謝。長(zhǎng)期攝入高脂飲食，外源性脂肪吸收增加，導(dǎo)致高脂血癥。當(dāng)高脂血癥形成后，肝臟攝取脂肪酸及其酯化作用增強(qiáng)，肝內(nèi)脂肪酸除部分合成磷脂和膽固醇外，主要合成TG，TG再與肝細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成的載脂蛋白結(jié)合，形成VLDL－TG釋放入血，當(dāng)肝內(nèi)TG過多超過了肝臟的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，或者VLDL分泌障礙時(shí)，均可導(dǎo)致TG在肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)堆積，從而壓迫肝血竇逐漸造成缺血、變性、壞死。因此，降低血脂、清除肝臟中堆積的脂肪是治療脂肪肝的重要方法之一［5］。在本實(shí)驗(yàn)中，高脂血癥性脂肪肝大鼠給予黃芩素4周后，能明顯降低高脂血癥性脂肪肝大鼠血清TC、TG、LDL－C和FFA，升高血清HDL－C，也能降低肝組織中的TC、TG含量和肝重系數(shù)。提示黃芩素可能通過調(diào)節(jié)血脂及肝臟脂質(zhì)的含量從而防治高脂血癥性脂肪肝。

脂質(zhì)過氧化是非酒精性脂肪肝發(fā)病機(jī)制的的重要環(huán)節(jié)。機(jī)體抗氧化能力減弱，體內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用加強(qiáng)，產(chǎn)生大量自由基不能被及時(shí)清除，造成組織損傷。SOD是體內(nèi)重要的清除氧自由基的酶，對(duì)機(jī)體的氧化/抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，可以保護(hù)肝組織細(xì)胞免受損傷。其活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。氧自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)，形成脂質(zhì)過氧化物，主要是MDA，其含量的高低可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細(xì)胞損傷程度［9］。因此，降低自由基引起的脂質(zhì)過氧化作用并提高機(jī)體清除自由基的能力是治療脂肪肝的另一重要途徑。在本實(shí)驗(yàn)中，黃芩素可以明顯降低肝組織中MDA的含量，提高SOD的活性，提示黃芩素可以通過降低自由基引起的脂質(zhì)過氧化作用并提高機(jī)體清除自由基的能力從而防治高脂血癥性脂肪肝。

另外，本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的血清ALT和AST水平升高，給予黃芩素四周后，能使高脂血癥性脂肪肝大鼠血清ALT和AST水平降低，提示黃芩素對(duì)脂肪肝大鼠肝臟有一定的保護(hù)作用。此外，病理學(xué)亦證實(shí)給與黃芩素四周后脂肪肝的嚴(yán)重程度明顯減輕，表明黃芩素可以改善高脂飲食脂肪肝大鼠的脂肪變性程度，并且可以在一定程度上改善脂肪肝的組織學(xué)變化。

綜上所述，黃芩素可以通過調(diào)節(jié)血脂、肝脂質(zhì)、抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生和提高機(jī)體清除自由基的能力，并保護(hù)肝臟，從而對(duì)高脂血癥性脂肪肝有有一定的防治作用。但是，由于中藥具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、多通路的特性，其機(jī)制也比較復(fù)雜。因此，黃芩素防治高脂血癥性脂肪肝的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

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