四物湯的HPLC指紋圖譜研究

黃月純， 魏 剛， 劉翠玲， 張瓊丹

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510405)

1 儀器與試藥

HP1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);二極管陣列檢測器(美國安捷倫公司);阿魏酸(批號 0773-9708)、5-羥 甲 基 糠 醛 (批 號 111626-200804)、沒食子酸(批號10831-200302)、芍藥苷(批號 110736-200933)、苯甲酸(批號 100419-200301)與兒茶素對照品(批號110877-200001)，由中國藥品生物制品檢定所提供;熟地黃、白芍、當(dāng)歸與川芎飲片，分別購于廣東多家藥材公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院黃月純主任中藥師鑒定，熟地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosaBgeLibisch.的干燥塊根的炮制加工品，白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根，當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖，以上四種飲片均符合中國藥典2005版一部項下的質(zhì)量要求，10批飲片按四物湯處方量配成10批;乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用 Zorbax SB-Aq(250 mm ×4.6mm，5μm)色譜柱;流動相為乙腈－0.05%磷酸溶液(梯度洗脫:0～20 min，乙腈為5%→10%;20～30 min，乙腈為10%→13%;30～40 min，乙腈為13%→20%;40～45 min，乙腈為20%;45～65 min，乙腈為20%→50%;65～70 min，乙腈為50%→55%);流速為1 mL/min，柱溫為35℃;白芍特征峰采用230 nm檢測波長，熟地黃、當(dāng)歸與川芎采用290 nm檢測波長為宜。

2.2 對照品溶液的制備

取沒食子酸、兒茶素、苯甲酸、芍藥苷對照品適量，用60%甲醇溶解配制成濃度分別為0.1 mg/mL的混合對照品溶液;取5-羥甲基糠醛、阿魏酸對照品適量，用60%甲醇溶解配制成濃度分別為0.1 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

按四物湯的處方配比(熟地黃、白芍、當(dāng)歸與川芎為12∶12∶10∶8)，取2.5日劑量的飲片，加水800 mL，浸泡30 min，加熱煮沸后文火慢煎40 min，取出，趁熱濾過，藥渣再加水500 mL加熱煮沸后文火慢煎30 min，取出，趁熱濾過，合并兩次煎液，放冷，置500 mL量瓶中，加水至刻度，得全方煎劑。精密吸取四物湯煎液4 mL，精密加入甲醇6 mL，放置2 h，超聲處理20 min，取出，放冷，離心，取上清液置10 mL量瓶中，加60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。取相同處方量的單味藥及缺味藥，同法制成單味煎劑及缺味煎劑供試品溶液。

2.4 230 nm檢測波長的分析

2.4.1 精密度試驗 分別精密吸取同一四物湯供試品溶液各10μL，連續(xù)進樣5次，結(jié)果10個共有峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值均小于3.0%。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一四物湯供試品溶液各10 μL，分別在 0、2.5、5、10、24 h 進樣 5 次。結(jié)果10個共有峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值均小于3.0%，表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性較好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 分別取同一批飲片5份，按供試品溶液的制備方法操作，各取供試品溶液10 μL，依法進樣分析，結(jié)果10個共有峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值均小于5.0%。

如果“中國沒有向美國明確提出南海是中國的核心利益”觀點成立，則“中國能不能捍衛(wèi)在南海的核心利益？”無需回答(盡管研究結(jié)論是明確可信的)，也就不會存在“南海核心利益說”所引起的南海緊張氣氛。但實際情況卻是，盡管“中國沒有向美國明確提出南海是中國的核心利益”觀點成立，“南海核心利益說”還是不脛而走，深刻影響南海局勢走向。必須明確的是：“南海核心利益說”的始作俑者和推動者是美國媒體、戰(zhàn)略界以及政界，其根本目的顯然是為美國的南海利益服務(wù)。

2.4.4 樣品的測定 精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μL，按擬定方法進樣分析。

2.4.5 白芍指紋圖譜的建立與分析

2.4.5.1 共有峰的確定 分析10批四物湯樣品，檢出33～38個特征峰，經(jīng)白芍單味煎劑及缺白芍煎劑對照，確定了10個共有峰，均為白芍的特征成分，見圖1。各樣品的出峰總數(shù)及其共有峰所占比例、共有峰面積及其所占比例見表1。

圖1 四物湯HPLC圖譜(230 nm)(A.四物湯 B.白芍煎劑 C.缺白芍煎劑)Fig.1 HPLC chromatograms of Siwu Decoction(230 nm)

表1 樣品出峰數(shù)及峰面積分析結(jié)果(230 nm)Tab.1 Results of peak numbers and areas of Siwu Decoction(230 nm)

2.4.5.2 共有峰的鑒別 通過對照品對照及參考文獻［7］共鑒別了7個特征峰，峰1、峰3、峰 4、峰 6、峰7、峰8、峰9分別為沒食子酸、芍藥苷亞硫酸酯、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷。

2.4.5.3 共有峰的分析 以芍藥苷峰為參照峰進行計算，各共有峰的分析結(jié)果見表2。

表2 四物湯HPLC指紋圖譜分析結(jié)果(230 nm)Tab.2 Results of HPLC fingerprint of Siwu Decoction(230 nm)Results

2.4.5.4 相似度分析 以國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2004A版)，計算相似度，結(jié)果在0.914～0.991之間。共有模式1見圖2。

圖2 10批四物湯生成的指紋圖譜共有模式1(230 nm)Fig.2 Common Pattern 1 of HPLC fingerprint of Siwu Decotion(230nm)

2.5 290 nm檢測波長的分析

2.5.1 精密度試驗 分別精密吸取同一四物湯供試品溶液各10 μL，按擬定方法連續(xù)進樣5次，結(jié)果17個共有峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值均小于3.0%。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一四物湯供試品溶液各10 μL，分別在 0、2.5、5、10、24 h 進樣 5 次。結(jié)果17個共有峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值均小于3.0%，表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性較好。

2.5.3 重復(fù)性試驗 分別取同一批飲片5份，按供試品溶液的制備方法操作，各取供試品溶液10 μL，依法進樣分析，結(jié)果17個共有峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值均小于5.0%。

2.5.4 樣品的測定 精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μL，按擬定方法進樣分析。

2.5.5 指紋圖譜的建立與分析

2.5.5.1 共有峰的確定 分析10批四物湯樣品，檢出34～38個特征峰，經(jīng)單味煎劑及缺味煎劑對照，確定了17個共有峰，其中6個峰歸屬熟地黃，其余歸屬當(dāng)歸與川芎的相同類成分，見圖3。各樣品的出峰總數(shù)及其共有峰所占比例、共有峰面積及其所占比例見表3。

圖3 四物湯HPLC圖譜(290 nm)Fig.3 HPLC Chromatograms of Siwu Decoction(290nm)

表3 樣品出峰數(shù)及峰面積分析結(jié)果(290 nm)Tab.3 Results of peak numbers and areas of Siwu Decoction(290 nm)

2.5.5.2 共有峰的鑒定 以對照品對照，鑒定了2個共有峰，其中峰4為5-羥甲基糠醛、峰11為阿魏酸。

2.5.5.3 共有峰的分析 以阿魏酸峰為參照峰進行計算，各共有峰的分析結(jié)果見表4。

表4 四物湯HPLC指紋圖譜分析結(jié)果(290 nm)Tab.4 Results of HPLC fingerprint of Siwu Decoction(290 nm)

2.5.5.4 相似度分析 以國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2004A版)，計算相似度，結(jié)果在0.942～0.999之間。共有模式2見圖4。

圖4 10批四物湯生成的指紋圖譜共有模式2(290 nm)Fig.4 Common pattern 2 of HPLC fingerprint of Siwu Decoction(290 nm)

3 討論

本研究篩選了色譜柱的型號、流動相系統(tǒng)及梯度，采用兩種檢測波長可對方中四味藥的特征峰均進行分析。

白芍的特征成分的含量較高，取湯劑加一定量的甲醇處理制備供試液，即可獲得較理想的分離效果。湯劑中的當(dāng)歸與川芎特征成分的含量相對較低，曾試驗采用有機溶媒萃取富集的方法制備供試液，但由于萃取對不同極性成分萃取效果的差異與濃縮過程部分成分損失，易造成特征峰相對比例的變化，不能體現(xiàn)湯劑中主要成分含量的相對比例，因此，分析熟地黃、當(dāng)歸與川芎的特征成分，采用與分析白芍特征成分的相同供試液。

230 nm波長能檢測四物湯中白芍的10個特征峰，與白芍飲片特征峰基本一致［7］。290 nm波長檢測的17個特征峰中，峰1～5，峰7歸屬熟地黃，峰4為熟地黃與川芎所共有，峰1、峰3、峰4的紫外光譜基本一致，可能同屬一類成分;峰6歸屬當(dāng)歸，峰8歸屬川芎，峰4部分歸屬川芎，峰9～17均歸屬當(dāng)歸與川芎，成分鑒別還有待于進一步研究。

通過10批四物湯的分析，不同批次湯劑均具有所標(biāo)示的共有峰，說明建立四物湯指紋圖譜的可行性。230 nm檢測波長下10樣品的相似度在0.914～0.991之間，290 nm檢測波長下10樣品的相似度在0.942～0.999之間。本研究為四物湯物質(zhì)基礎(chǔ)探討提供了一定參考，同時亦為含熟地黃、白芍、當(dāng)歸、川芎的復(fù)方煎劑指紋圖譜研究提供一定參考。

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