北柴胡HPLC-ELSD指紋圖譜的建立及色譜數(shù)據(jù)的分析

王啟帥， 楊 云， 肖功勝， 馮衛(wèi)生

(河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南鄭州 450008)

傘形科柴胡屬植物柴胡Bupleuri Radix作為中 醫(yī)復(fù)方中的常用中藥在中國已沿用了近千年。中醫(yī)主要用其治療胸肋脹痛、子宮脫垂、脫肛、流感及感冒所引起的發(fā)熱等。中國藥典收載的正品柴胡藥材來源為柴胡Bupluerum chinenseDC.和狹葉柴胡Bupluerum scorzonerifoliumWilld.的干燥根，前者習(xí)稱為北柴胡，后者習(xí)稱為南柴胡［1］。但在某些地區(qū)性藥材市場偶有發(fā)現(xiàn)以柴胡屬其他品種諸如錐葉柴胡Bupluerum bicauleHelm.、黑柴胡Bupluerum smithiiWolff.充當(dāng)藥用柴胡的現(xiàn)象。如黑龍江、內(nèi)蒙古、青海、甘肅、寧夏、西藏等地，人們習(xí)慣以黑柴胡作為藥用柴胡品種［2，3］?，F(xiàn)代研究表明三萜皂苷類成分普遍存在于柴胡屬植物中，是柴胡主要的生物活性成分之一，柴胡皂苷d(saikosaponin-d，SSd)具有抑制肝組織纖維化［4-5］、抑制肝臟癌細(xì)胞的增殖［6］及保護(hù)肝細(xì)胞的功能［7］，柴胡皂苷 a(saikosaponin-a，SSa)是柴胡抗癲癇作用的主要生物活性成分［8］。

中藥色譜指紋圖譜分析技術(shù)是當(dāng)前進(jìn)行復(fù)雜物質(zhì)體系研究的重要手段，它已成為一種用于鑒定中藥及評價中藥質(zhì)量的有效手段。對于柴胡HPLC色譜指紋圖譜的研究，已有學(xué)者［9-10］進(jìn)行了相關(guān)方面的探索研究，所用的檢測手段以紫外檢測器(UVD)或光電二極管陣列檢測器(DAD)為主。但由于柴胡三萜皂苷結(jié)構(gòu)中無較長的共軛體系，全波段(190-900 nm)掃描SSa，SSd只存在紫外末端吸收。利用紫外末端吸收作為檢測手段對流動相純度要求很高，同時紫外檢測器在低波長時基線易產(chǎn)生漂移，影響柴胡皂苷的分析。蒸發(fā)光散射檢測器為質(zhì)量型檢測器，其測定方法不依賴于樣品的光學(xué)性質(zhì)，適用于無紫外吸收的化學(xué)成分的檢測。本研究運用高效液相(HPLC)結(jié)合蒸發(fā)光散色檢測器(ELSD)建立北柴胡HPLC指紋圖譜的分析方法，并運用聚類分析及主成分分析的理論及分析方法對指紋圖譜的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以期提取出北柴胡及黑柴胡中三萜皂苷類成分指紋圖譜的特征信息，并在此基礎(chǔ)上探討北柴胡與黑柴胡指紋圖譜信息的差異性。為柴胡藥材的質(zhì)量控制及評價提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SUMMIT高效液相色譜儀配備“CHROMELEONTM”工作站(美國DIONEX公司);2000ES蒸發(fā)光散色檢測器(美國ALLTECH公司);ChromafingerTM2005色譜指紋圖譜系統(tǒng)解決方案軟件(珠?？坡兴幯芯坑邢薰?;Hydro-RP80A色譜柱(廣州phenomenex公司);METTLER AE240電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);BS210S型電子天平(北京賽多利斯天平公司);SZ-93型自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠);及其他相關(guān)各種玻璃儀器。

1.2 試劑 SSa，SSd對照品(本實驗室自制［11］，由峰面積歸一化法測定含量均大于98%);色譜級乙腈(美國TIDEA公司);其他相關(guān)試劑均為分析純。

1.3 藥材 柴胡樣品共17批，來自于陜西、山西、河南、河北、內(nèi)蒙古等柴胡主產(chǎn)區(qū)。所有樣品經(jīng)由河南中醫(yī)學(xué)院生藥教研室董誠明教授鑒定，結(jié)果見表1。按2010版《中國藥典》柴胡項下規(guī)定加工:除去莖葉及泥沙，40℃烘箱干燥24 h，粉碎，過10目篩，干燥器內(nèi)室溫保存。

表1 柴胡樣品來源及編號Tab.1 Sample source and number

2 試驗方法

2.1 供試品溶液的制備 取柴胡粉末1 g，精密稱定，精密加入甲醇40 mL，超聲提取1 h，濾過，用5 mL甲醇洗滌濾渣，合并濾液并水浴80℃揮干，剩余物加10 mL蒸餾水溶解，飽和正丁醇萃取3次，每次10 mL，合并正丁醇萃取液，水浴80℃揮干，剩余物以甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶內(nèi)，定容，搖勻，微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

2.2 對照品溶液的制備 取柴胡皂苷a，d各3 mg，精密稱定，置5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

2.3 液相色譜條件 Hydro-RP80A C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL/min;流動相:乙腈(A)-水(B)梯度洗脫，洗脫程序為:0 min:15%A，85%B;15 min:30%A，70%B;25 min:35%A，65%B;40 min:45%A，55%B;60 min:50%A，50%B;70 min:15%A，85%B。記錄時間:60 min;恢復(fù)平衡時間:10 min。檢測器:蒸發(fā)光散射檢測器;漂移管溫度:110℃;空氣流速:3.0 L/min。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 在2.3項下色譜條件對SSa，SSd對照品及空白溶液進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1～3。結(jié)果表明:空白溶劑無干擾，系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

圖1 空白溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of the blank solution

圖2 柴胡皂苷a對照品色譜圖Fig 2 Chromatogram of saikosaponin-a

圖3 柴胡皂苷d對照品色譜圖Fig 3 Chromatogram of saikosaponin-d

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗 按2.3項下色譜條件對同一供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣測定5次，記錄色譜圖。以SSd(10號色譜峰)為內(nèi)參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果顯示:各共有峰的相對保留時間的RSD為0.01% ～0.18%，相對峰面積的RSD為1.70%～4.49%。認(rèn)為儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 取柴胡粉末適量，按2.1項下制備，并在制備后0、6、10、14、18、24 h 進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以SSd(10號色譜峰)為內(nèi)參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果顯示:各共有峰的相對保留時間的RSD為0.10%～0.19%，相對峰面積的RSD為1.05% ～4.24%。認(rèn)為供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗 取同一批樣品5份，按2.1項下平行制備，按2.3項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以SSd(10號色譜峰)為內(nèi)參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果顯示:各共有峰的相對保留時間的RSD為0.11% ～0.17%，相對峰面積的RSD為1.04%～4.85%。認(rèn)為該方法重復(fù)性良好。

3 結(jié)果與分析

3.1 樣品指紋圖譜測定

取17批柴胡樣品粉末，按2.1項制備，制成供試液并在2.3項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。樣品指紋圖譜色譜圖見圖4～5。

圖4 北柴胡樣品色譜圖(樣品編號為4號，產(chǎn)地為河北豐寧)Fig.4 Chromatogram of B.chinense DC.(the sample numbered 4，was from Fengning，Hebei province)

圖5 黑柴胡樣品色譜圖(樣品編號為17，產(chǎn)地為內(nèi)蒙古)Fig.5 Chromatogram of B.smithii Wolff.(the sample numbered 17，was from Inner Mongolia Autonomous Region，China)

3.2 指紋圖譜共有模式的建立

利用CHROMAP色譜指紋圖譜系統(tǒng)解決方案軟件，以4號樣品(河北豐寧)的指紋圖譜為保留時間參考標(biāo)準(zhǔn)，選取峰面積較大且較穩(wěn)定，分離度好的SSd色譜峰作為內(nèi)參照峰，對10批北柴胡樣品(樣品編號為1～10)的色譜指紋峰進(jìn)行匹配，結(jié)果見圖6。

圖6 北柴胡樣品HPLC-ELSD指紋圖譜疊加圖(n=10，從內(nèi)至外樣品編號依次為1，2，3，…，10)Fig.6 HPLC-ELSD fingerprints of B.chinense DC.(n=10.From interior to exterior，there are 1，2，3，…，10 successively.)

將出現(xiàn)頻率為100%的色譜峰界定為指紋圖譜共有峰，以中位數(shù)法篩選指紋圖譜特征及計算色譜峰面積值，獲得12個共有峰(保留時間及相對峰面積見表2)。運用高斯曲線對共有模式進(jìn)行色譜基線校正，生成了北柴胡的HPLC-ELSD指紋圖譜共有模式，見圖7。

圖7 北柴胡HPLC-ELSD指紋圖譜共有模式(高斯曲線模擬合成圖)Fig.7 HPLC-ELSD fingerprint common pattern of B.chinense DC.(the common pattern was simulated by Gaussian curve)

3.3 指紋圖譜相似度計算

相似度(similarity)是評價中藥指紋圖譜的一個重要參數(shù)，它是根據(jù)指紋圖譜的整體相似程度來計算中藥化學(xué)組分的整體波動程度，據(jù)此分析中藥制劑的穩(wěn)定性及中藥化學(xué)成分的均一性。應(yīng)用最廣且最適用于中藥材指紋圖譜相似度評價的方法為夾角余弦法和相關(guān)系數(shù)法。夾角余弦(cosine ratio)是歐幾里德幾何中度量兩組向量之間夾角大小的角度向量之一。相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient)是多元統(tǒng)計學(xué)中用來衡量兩組變量之間的線性密切程度的無量綱指標(biāo)。相關(guān)系數(shù)或余弦值越趨近于1說明兩向量越相似。以北柴胡指紋圖譜共有模式(CP)作為17批樣品指紋圖譜色譜峰匹配的依據(jù)及計算參考，對樣品指紋圖譜進(jìn)行相似度評價。以樣品編號為橫坐標(biāo)，相似度評價結(jié)果為縱坐標(biāo)，得到樣品相似度評價結(jié)果散點圖，見圖8。

相似度越高說明柴胡樣品間化學(xué)成分均一性越好。從結(jié)果可以得出:(1)不同產(chǎn)地北柴胡樣品中的化學(xué)成分具有良好的相似性(大于0.9);(2)生長年限在17～22個月的北柴胡樣品之間具有較高的相似度(大于0.9);(3)人工栽培北柴胡與野生北柴胡樣品之間亦具有較高的相似度(大于0.9);(4)黑柴胡樣品(編號為15，17)與北柴胡指紋圖譜共有模式的相對峰面積存在明顯的差異是致使黑柴胡樣品與北柴胡共有模式相似性偏低的原因。

3.4 指紋圖譜的聚類分析

圖8 樣品相似度評價結(jié)果散點圖(A.計算方法為相關(guān)系數(shù)法;B.計算方法為夾角余弦法)Fig.8 Scatter plot of similarity of samples(A.the calculation was the correlation;B.the calculation was the cosine ratio)

聚類分析(cluster analysis)是將沒有分類信息的資料按相似或相近程度分類，以使聚為同一類的樣品具有共同的表達(dá)模式。通過聚類分析可反映出樣品之間的特定關(guān)系。以樣品指紋圖譜中的共有峰作為描述樣品特征的數(shù)據(jù)變量(變量經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化變換)，樣品距離度量采用歐幾里德(Euclidean)距離，采用最鄰近法描述兩個樣品的相似程度。對17批樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖9。

圖9 樣品聚類分析樹狀圖Fig.9 Dendrogram for samples

結(jié)果顯示:當(dāng)分類距離取2時，可將北柴胡樣品與黑柴胡樣品分聚為不同的類別;當(dāng)分類距離取1時，不僅能將北柴胡樣品與黑柴胡樣品區(qū)分開，還可將生長年限為15個月的北柴胡樣品(樣品編號為14和16)與品質(zhì)較好的北柴胡樣品(樣品編號1～10)區(qū)分開。從分類距離的劃分可以看出，雖然不同生長年限的北柴胡指紋圖譜之間存在差異，但相對于北柴胡樣品與黑柴胡樣品之間的差異而言，北柴胡樣品的表達(dá)模式仍存在一定的共性。

3.5 主成分分析

主成分分析(principal component analysis，PCA)是最常用的多指標(biāo)線性降維壓縮和多變量分析方法。它可將原有眾多具有一定相關(guān)性的變量，重新組合成一組新的、相互無關(guān)的綜合指標(biāo)來代替原有的變量，從而實現(xiàn)以最少的主成分盡可能多的體現(xiàn)原變量的信息。運用色譜指紋圖譜系統(tǒng)解決方案軟件，以17批柴胡樣品的指紋圖譜的共有峰為分析數(shù)據(jù)源，利用指紋圖譜共有峰峰面積描述樣品的特征，通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(主成分個數(shù)為10)，分析結(jié)果見表2。

表2 北柴胡HPLC-ELSD指紋圖譜共有峰及17批樣品主成分分析結(jié)果Tab.2 The co－possessing peaks of HPLC－ELSD fingerprint and the result of principal component analysis based on 17 batches of samples.

表2可以看出:以共有峰為表達(dá)模式的樣品信息，可通過主成分分析重新組合成10個主成分對原有變量信息作出概括，新的指標(biāo)可以概括平均99.76%的原有變量信息(累計均方差為99.76%)。值得注意的是:第一主成分(PC1)與第二主成分(PC2)已經(jīng)能概括原始變量平均88.98%的信息(累計均方差為88.98%)，一般當(dāng)累積均方差大于70%時，可以認(rèn)為新指標(biāo)是有效的。將17批樣品在空間內(nèi)的坐標(biāo)投影于主成分PC1-PC2所確定的平面內(nèi)，得到樣品在平面內(nèi)的分布散點圖，見圖10。

從樣品分布散點圖可看出，北柴胡樣品與黑柴胡樣品之間的差異可通過PC1體現(xiàn)出來;北柴胡樣品之間的差異由PC2體現(xiàn)。從表2中的因子得分系數(shù)矩陣可看出:在PC1中，peak7(p7)，p10的得分絕對值最高，即PC1與化合物SSa，SSd的關(guān)系最密切;同理，與PC2關(guān)系最密切的色譜峰為 p4，p5，p12。

4 討論

4.1 色譜柱的選擇

圖10 樣品在PC1-PC2坐標(biāo)內(nèi)的分布散點圖Fig.10 Scatter plot of PCA on two principal components

本試驗考察了Hypersil ODS2(大連伊利特)，Luna C18(2)100A(廣州 phenomenex)及 Hydro-RP80A(廣州phenomenex)3種型號色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)利用前兩種色譜柱所得到的色譜峰存在拖尾現(xiàn)象，系統(tǒng)適應(yīng)性較差，而Hydro-RP80A色譜柱對差向異構(gòu)體SSa，SSd的分離效果較好而且色譜峰分布均勻。故本試驗最終選用Hydro-RP80A色譜柱進(jìn)行色譜分析。

4.2 流動相的選擇

試驗中曾嘗試用甲醇-水等度洗脫的可行性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)等度洗脫分離效果遠(yuǎn)不及梯度洗脫，且將甲醇換為乙腈能使分離效果明顯提高。用乙腈-水進(jìn)行梯度洗脫，可有效地縮短分析時間，使色譜圖的基線平穩(wěn)，樣品色譜圖中SSa，SSd色譜峰的分離度均大于1.5。而且60 min后已無色譜峰，分析時間符合指紋圖譜的相關(guān)要求。故選擇乙腈-水進(jìn)行梯度洗脫，分析70 min，取60 min內(nèi)的色譜圖為分析對象，10 min用于平衡洗脫條件。

4.3 本研究以8批野生北柴胡樣品(產(chǎn)地分別為山西，陜西，遼寧，河北，河南)及2批人工栽培北柴胡樣品(產(chǎn)地為河南嵩縣規(guī)范化種植基地及河南輝縣)共10批，建立北柴胡的HPLC-SLSD指紋圖譜共有模式。以此共有模式中的色譜峰為匹配依據(jù)，對所有17批柴胡樣品(包含2批黑柴胡樣品)進(jìn)行相似度、聚類分析及主成分分析。相似度分析是將指紋圖譜看成一個整體，對樣品指紋圖譜的整體差異進(jìn)行量化描述。夾角余弦法和相關(guān)系數(shù)法是在指紋圖譜評價中應(yīng)用最廣泛的計算方法，夾角余弦法描述的是樣品的空間距離。而相關(guān)系數(shù)法反應(yīng)的是樣品的“輪廓”特征。通過兩種相似度計算方法的比較得出:相關(guān)系數(shù)法與夾角余弦法均適用于色譜指紋圖譜的相似度計算，雖然計算結(jié)果存在差異，但所得趨勢是相同的。聚類分析是以色譜數(shù)據(jù)(本試驗為色譜峰)來表征樣品的特征，并通過對數(shù)據(jù)的計算，將具有共同表達(dá)模式的樣品以某種方式聚為一類群內(nèi)。結(jié)合指紋圖譜相似度及聚類分析結(jié)果可判定，編號為15和17的兩個柴胡樣品為離群樣品，即無論是以整個色譜圖為衡量角度還是以色譜峰為衡量角度，北柴胡樣品與黑柴胡樣品之間均存在差異。運用主成分分析對色譜峰間的差異進(jìn)行分析，結(jié)合表2與圖10的結(jié)果可得出:第一主成分中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的因子得分絕對值較高且相對峰面積較大，因此將PC1稱為“主皂苷因子”。同理，第二主成分中色譜峰p4，p5，p12的得分絕對值較高，但相對峰面積較低，因此將PC2稱為“微量皂苷因子”。綜合聚類分析及主成分分析結(jié)果可得出:北柴胡樣品與黑柴胡樣品的差異主要存在于主皂苷成分上，而不同生長年限的北柴胡樣品之間的差異主要存在于微量皂苷成分上。

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