反相高效液相色譜法同時測定仙靈骨葆滴丸中淫羊藿苷和補(bǔ)骨脂素及異補(bǔ)骨脂素的含量

錢南萍， 萬維香， 魏潤新

(江蘇泰州市人民醫(yī)院，江蘇泰州 225300)

仙靈骨葆能顯著提高腰椎骨密度，對中老年和絕經(jīng)期患者以及骨折、骨壞死、骨關(guān)節(jié)炎等骨病有良好的療效和安全性［1］。仙靈骨葆滴丸是由淫羊藿、補(bǔ)骨脂、川續(xù)斷等多味中藥組成，具有滋補(bǔ)肝腎，接骨續(xù)筋的功效，用于骨質(zhì)疏松癥，骨折，骨關(guān)節(jié)炎，骨無菌性壞死等。處方中主藥淫羊藿作為傳統(tǒng)的補(bǔ)腎壯陽中藥，因其獨特的化學(xué)成分和顯著的生物活性一直是國內(nèi)外研究的熱點之一［2］，而補(bǔ)骨脂素及異補(bǔ)骨脂素亦是補(bǔ)骨脂中的主要活性成分。目前文獻(xiàn)對仙靈骨葆質(zhì)量的控制主要是分別檢測淫羊藿苷的含量或補(bǔ)骨脂素及異補(bǔ)骨脂素［3-5］，為有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本實驗采用高效液相色譜法同時測定仙靈骨葆滴丸中淫羊藿苷和補(bǔ)骨脂素及異補(bǔ)骨脂素的含量，方法簡便可行，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters HPLC系統(tǒng)(1525泵、2487紫外可見光光度檢測器、Empower色譜工作站)。

1.2 試藥 仙靈骨葆滴丸(江蘇清江藥業(yè)有限公司，批號:20070104、20070106、20070108);淫羊藿苷對照品(批號0737-200111);補(bǔ)骨脂素對照品(批號0730-200309)、異補(bǔ)骨脂素對照品(批號0738－200108)均為中國藥品生物制品檢定所提供;甲醇為色譜純(Merck KgaA，Germany);冰醋酸(分析純，南京化學(xué)試劑廠);超純水:自制。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil-C18(5 μm，250 mm×4.6 mm);流動相:甲醇-1.5%冰醋酸水溶液(55∶45);檢測波長:246 nm;流速:0.8 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:30 ℃。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對照品適量，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL含淫羊藿苷 836.8 μg、補(bǔ)骨脂素 97.28 μg、異補(bǔ)骨脂素75.52 μg的混合溶液，搖勻，以此作為對照品貯備液。精密吸取上述對照品貯備液1 mL，加甲醇稀釋至4 mL，搖勻，制成對照品溶液。

2.2.2 樣品溶液的制備 精密稱取仙靈骨葆滴丸1.010 9 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-水(50∶50)的溶液10 mL，稱定重量，超聲處理1 h，放冷，再稱定重量，用上述溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液用微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 精密稱取缺淫羊藿和補(bǔ)骨脂的陰性滴丸0.999 6 g，按樣品溶液的制備方法制成陰性溶液即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗 取對照品混合溶液、樣品溶液和陰性樣品溶液，按2.1項下色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL測定，結(jié)果表明，在此色譜條件下，淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素分離良好，陰性樣品對測定無干擾，結(jié)果見圖1。

2.4 線性關(guān)系實驗 精密吸取對照品溶液0.125、0.25、0.5、0.75、1.0 mL，分別置于 2 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件，依次進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，將所得峰面積與進(jìn)樣量進(jìn)行線性回歸，得淫羊藿回歸方程為Y=1 610 060.305X+50 445.034(r=0.999 7);補(bǔ)骨脂素回歸方程為Y=9 997.497X+32 817.220(r=0.999 7);異補(bǔ)骨脂素回歸方程為Y=11 049.64X+15 105.56(r=0.999 6)。結(jié)果表明，淫羊藿苷進(jìn)樣量在0.523～4.184 μg范圍內(nèi)、補(bǔ)骨脂素進(jìn)樣量在60.8～486.4 ng范圍內(nèi)、異補(bǔ)骨脂素進(jìn)樣量在47.2～377.6 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗 精密吸取淫羊藿苷(209.2 μg/mL)、補(bǔ)骨脂素(24.32 μg/mL)、異補(bǔ)骨脂素(18.88 μg/mL)對照品混合溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，結(jié)果，淫羊藿苷峰面積平均值為3 435 974，RSD為1.09%;補(bǔ)骨脂素峰面積平均值為2 466 573，RSD為0.34%;異補(bǔ)骨脂素峰面積平均值為2 094 161，RSD為0.53%。試驗表明，該法精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗 取同一批號樣品6份，按2.2.2項下方法制備樣品溶液，進(jìn)行測定，結(jié)果淫羊藿苷含量RSD為1.4%;補(bǔ)骨脂素含量RSD為2.04%;異補(bǔ)骨脂素含量RSD為1.82%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一樣品溶液10 μL，在0、2、4、6、8、12 h 分別進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果，淫羊藿苷峰面積RSD為1.12%;補(bǔ)骨脂素峰面積RSD為1.64%;異補(bǔ)骨脂素峰面積RSD為1.10%，表明樣品溶液中淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗 精密稱取6份已知含量的仙靈骨葆細(xì)粉適量(約0.4 g)，置錐形瓶中，分別精密加入一定量的淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對照品溶液，揮干溶劑后，加甲醇-水(50:50)10 mL，精密稱定，密塞，超聲提取1 h，放冷，精密稱定，再用甲醇-水(50:50)補(bǔ)足減失重量，用微孔濾膜濾過，精密吸取續(xù)濾液按2.1項下色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)Tab.1 Results of recovery test(n=6)

2.9 樣品測定 取3批樣品，按2.2.2項下方法制備樣品溶液，按2.1項下色譜條件測定，記錄峰面積，代入回歸方程計算樣品中淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 流動相的選擇 本實驗參考有關(guān)文獻(xiàn)［6-7］，分別選擇不同比例的甲醇-1.5%冰醋酸溶液為流動相，均可使處方中3種成分較好的分離，但實驗結(jié)果表明，采用甲醇-1.5%冰醋酸溶液(55:45)為流動相，3種成分的分離效果和峰形較理想。

表2 樣品含量測定結(jié)果(n=3)Tab.2 Content determination of samples(n=3)

3.2 提取條件的選擇 試驗過程中對供試品溶液的處理方法進(jìn)行了考察，通過分別采用甲醇、甲醇-水的不同比例超聲提取，并對不同提取時間進(jìn)行比較試驗，實驗中將樣品分別超聲0.5、1、1.5 h后測定淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的含量，結(jié)果表明，用甲醇-水(50:50)，超聲1 h處理樣品為最佳，可使樣品中的淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素提取完全，并能很好地避免滴丸中其他成分的干擾。

3.3 測定波長的選擇 經(jīng)紫外掃描得知淫羊藿苷的最大吸收波長是270 nm，而補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的最大吸收波長是246 nm，文獻(xiàn)報道［8-11］為分別采用246，270 nm進(jìn)行測定的，根據(jù)實驗結(jié)果，表明采用246 nm同時測定3種成分時的響應(yīng)值和峰形均優(yōu)于采用270 nm測定結(jié)果。本實驗建立的HPLC法，通過對色譜條件的優(yōu)化，可以同時測定仙靈骨葆滴丸中3種有效成分含量，方法操作簡便，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為該品種實際生產(chǎn)中質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)。

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