小劑量芬太尼聯(lián)合咪達(dá)唑侖對(duì)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元鈉離子通道電流的影響*

楊云春，周 賢，伍佳麗，姜 鮮，周述芝，王曉斌

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，四川 瀘州 646000)

大腦皮質(zhì)神經(jīng)元參與了意識(shí)的形成和維持意識(shí)清醒，而皮質(zhì)功能是通過各種離子通道完成，其中鈉離子通道開放引起的去極化內(nèi)向電流是其產(chǎn)生動(dòng)作電位的關(guān)鍵。咪達(dá)唑侖是目前臨床上廣泛應(yīng)用的鎮(zhèn)靜催眠藥，其作用位點(diǎn)與神經(jīng)元電壓門控型鈉離子通道有關(guān)[1];而芬太尼為阿片類鎮(zhèn)痛藥，但鎮(zhèn)靜效果欠佳。兩者臨床上常小劑量復(fù)合應(yīng)用于局部麻醉強(qiáng)化用藥，但其聯(lián)合應(yīng)用后發(fā)生協(xié)同效應(yīng)的原因目前還不完全清楚，亦未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選擇大腦皮質(zhì)神經(jīng)元作為研究對(duì)象，觀察鎮(zhèn)靜劑量咪達(dá)唑侖和芬太尼對(duì)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元上的鈉離子通道電流的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

選SD新生大鼠(1～3 d)，雌雄不拘，清潔級(jí)，由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;膜片鉗放大器(AXOPA/PFTCH200B Axon Instruments USA)，微管電極拉制器(PC-10NARISHIGE JAPA/PFN)，倒置相差顯微鏡(AXIOVERT135 ZEISS GERMANY)，A/D、D/A 轉(zhuǎn)換器(DIGIDATA-1200Axon Instruments USA)，二氧化碳孵箱(1815Tc SHEL-LAB U.S.A)，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)pClamp軟件(10.1)(Axon Instruments);咪達(dá)唑侖(2 mg/2 ml)、芬太尼(0.01μg/2 ml，湖北宜昌人福藥業(yè)有限公司)，TTX(河豚毒素，大連瑞芳化學(xué)公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法與分組

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 選用1～3天SD新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元行原代培養(yǎng)。取培養(yǎng)第4～9天的細(xì)胞用于全細(xì)胞膜片鉗記錄。

1.2.2 膜片鉗實(shí)驗(yàn)記錄 應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗法進(jìn)行記錄，選用形態(tài)呈錐體形，有一較長軸突和1～3個(gè)樹突的細(xì)胞進(jìn)行記錄，用經(jīng)100%O2飽和的細(xì)胞外液做持續(xù)灌流。兩步法拉制玻璃微電極，內(nèi)充電內(nèi)液后，阻抗2～5 MΩ。采樣頻率20kHz，低通濾波1 kHz，在電極尖端與細(xì)胞膜接觸形成巨阻封接(＞1 GΩ)后，吸破尖端膜片形成全細(xì)胞狀態(tài)，補(bǔ)償電容和串聯(lián)阻抗后，進(jìn)行下一步電流記錄。數(shù)據(jù)采集、貯存和分析實(shí)驗(yàn)中全細(xì)胞電流信號(hào)由計(jì)算機(jī)采集，電刺激脈沖的輸出以及電信號(hào)的采入均通過計(jì)算機(jī)程序pClamp10.1及digidata1200轉(zhuǎn)換器接口來完成。全細(xì)胞模型記錄鈉通道電流(INa)的鉗制電壓為-90mV，從-80mV開始以10mV遞增的去極化方波刺激，時(shí)間持續(xù)50ms，直到30mV ，記錄電流變化，繪制電流電壓曲線。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 空白組:用不含藥物的細(xì)胞外液灌流記錄最大鈉離子通道電流;F5組:用含5μg/L芬太尼的細(xì)胞外液灌流記錄最大鈉離子通道電流;F5+M200組:用含200μg/L咪達(dá)唑侖以及5μg/L芬太尼的細(xì)胞外液灌流記錄最大鈉離子通道電流。各組總共記錄5個(gè)細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用pClamp10.1軟件(Axon Instruments)進(jìn)行分析處理。采用同一膜片實(shí)驗(yàn)前后自身對(duì)照，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，顯著性檢驗(yàn)采用配對(duì) t檢驗(yàn)，t檢驗(yàn)采用SPSS 14.0軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元上鈉離子通道的電生理特性

采用全細(xì)胞電壓鉗制脈沖刺激模式記錄大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞膜上鈉離子通道電流(INa)，保持電位(holding potential，hp)為-90mV，測(cè)試電壓(test potential，TP)為-80mV 到+30mV，脈沖階躍步長為10mV，共12個(gè)階躍，鉗制時(shí)間(Clamp time，ct)為50ms，引出大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞膜上的 INa.該電流為快速激活的內(nèi)向電流，持續(xù)時(shí)間約 5 ms，能被1μmol/L的TTX阻斷，而TTX為鈉離子電流的特異性阻斷劑，同時(shí)在電極內(nèi)液中不含鈣離子且含鈣離子螯合劑EGTA，細(xì)胞外液中加入了鈣離子特異性阻斷劑CdCl2，因此可以證實(shí)該電流為對(duì)TTX敏感的鈉電流。

2.2 咪達(dá)唑侖復(fù)合芬太尼對(duì)鈉離子通道電流的影響

2.2.1 各個(gè)細(xì)胞用藥前后最大電流變化 用藥前細(xì)胞平均最大電流為(-267.00±115.36)pA/pF，而用藥后，F(xiàn)5組平均最大電流為(-231.90±97.16)pA/pF，與空白組比較，有顯著性差異(n=5，P＜0.05);200μg/L咪達(dá)唑侖合用5μg/L芬太尼(F5+M200)灌流后平均最大電流為(-213.98±91.68)pA/pF，與F5組比較，也存在顯著性差異(n=5，表1)。

Tab.1 Changes of density of sodium peak currents in cortical neurons

2.2.2 同一個(gè)細(xì)胞在不同膜電壓刺激下各組鈉離子通道電流 圖1表示鉗制電位為-90mV時(shí)，自-80mV起，刺激電壓每次增加10mV，直到+30mV;在同一個(gè)細(xì)胞上所記錄到的電流曲線圖，可見電流幅度的變化。A為對(duì)照組，B為F5組，C為F5+M200組，D為用細(xì)胞外液灌流后電流恢復(fù)情況。

Fig.1 Changes of voltage-gated sodium channels currents of cortical neuron in different voltages

2.2.3 芬太尼、芬太尼復(fù)合咪達(dá)唑侖對(duì)細(xì)胞電流-電壓曲線的影響 圖2表示以不同電壓下的最大電流值為縱坐標(biāo)，刺激電壓為橫坐標(biāo)的電流-電壓曲線圖，從電流電壓曲線圖可以看出，芬太尼合用咪達(dá)唑侖后，對(duì)鈉離子通道的電流抑制程度較單用芬太尼時(shí)明顯增強(qiáng)。

Fig.2 Changes of sodium channels currents-voltage of cortical neuron in different groups

3 討論

隨著分子生物學(xué)和神經(jīng)生理學(xué)的迅速發(fā)展，人們對(duì)全麻藥的作用機(jī)理認(rèn)識(shí)不斷提高，目前認(rèn)為全麻藥主要作用于膜蛋白而非膜脂質(zhì)，隨著膜片鉗技術(shù)的發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明神經(jīng)細(xì)胞膜上的離子通道是全麻藥的作用靶位[1～3]。由于電壓門控型鈉離子通道是可興奮性細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位和傳導(dǎo)神經(jīng)沖動(dòng)的關(guān)鍵部位和決定因素，對(duì)神經(jīng)元的聯(lián)系和整合功能起著極其重要的作用，因此被認(rèn)為是全麻藥分子作用靶位。皮質(zhì)神經(jīng)元是大腦中的最重要部分，參與意識(shí)的形成和維持意識(shí)清醒，是記憶的重要編碼部位。而皮質(zhì)的功能通過各種離子通道完成，其中鈉離子通道開放引起的去極化內(nèi)向電流是興奮性細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位的關(guān)鍵。咪達(dá)唑侖是目前臨床上廣泛應(yīng)用的鎮(zhèn)靜藥，主要用于全麻的誘導(dǎo)以及局部麻醉后的鎮(zhèn)靜，具有起效快，作用時(shí)間短，有較優(yōu)良的順行性遺忘作用，但是缺乏鎮(zhèn)痛作用;而芬太尼為阿片類鎮(zhèn)痛藥，但是鎮(zhèn)靜效果欠佳。因此兩者作用互補(bǔ)，應(yīng)用在鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等方面具有協(xié)同作用[4]，從而減少單一藥物的用量，降低不良反應(yīng)的發(fā)生，到目前為止，文獻(xiàn)證實(shí)咪達(dá)唑侖復(fù)合芬太尼在鎮(zhèn)靜效能方面是比較理想的選擇。但就其聯(lián)合應(yīng)用后發(fā)生協(xié)同效應(yīng)的原因目前還不完全清楚，亦未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

因此本實(shí)驗(yàn)選擇大腦皮質(zhì)神經(jīng)元作為研究對(duì)象，觀察鎮(zhèn)靜劑量咪達(dá)唑侖 200μg/L和芬太尼5μg/L(在定量藥理學(xué)中，不同種屬間藥物量的換算公式DB=DA*(WA/WB)1/3*RB/RA，DB為要求得的B種動(dòng)物的公斤體重劑量，DA是已知A種動(dòng)物的公斤體重劑量;WA、WB為已知?jiǎng)游矬w質(zhì)量，RB、RA是體型系數(shù)。大鼠的體型系數(shù)是0.09，人的體型系數(shù)是0.1)對(duì)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元上的鈉離子通道電流的影響對(duì)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元上的鈉離子通道電流的影響，探討兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用后藥理學(xué)作用增強(qiáng)的分子作用機(jī)制。在本實(shí)驗(yàn)之前，我們通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，咪達(dá)唑侖對(duì)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元鈉離子通道電流的影響輕微，亦未表現(xiàn)出濃度依賴性抑制，因此在本實(shí)驗(yàn)過程中，未再單獨(dú)觀察咪達(dá)唑侖對(duì)鈉離子通道電流的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小劑量芬太尼聯(lián)合咪達(dá)唑侖后對(duì)鈉離子通道電流的抑制明顯大于對(duì)照組和單用小劑量芬太尼組，其P值均小于0.05，提示兩藥合用后對(duì)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元鈉離子通道電流抑制作用增強(qiáng)，這可能是兩種藥物臨床合用后鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛作用增強(qiáng)的機(jī)制之一。

[1]Zhou X，Dong X W，Priestley T.The neuroleptic drug，fluphenazine，blocks neuronal voltage-gated sodium channels[J].Brain Res，2006，1106(1):72-81.

[2]Haeseler G，F(xiàn)oadi N，Ahrens J，et al.Tramadol，fentanyl and sufentanil but not morphine block voltage-operated sodium channels[J].pain，2006，126(1-3):234-244.

[3]Martella G，De Persis C，Bonsi P，et al.Inhibition of persistent sodium current fraction and voltage-gated L-type calcium current by propofol in cortical neurons:implications for its antiepileptic activity[J].Epilepsia，2005，46(5):624-635.

[4]Baris S，Karakaya D，Aykent R，et al.Comparison of midazolam with or without fentanyl for conscious sedation and hemodynamics in coronary angiography[J].Can J Cardiol，2001，17(3):277-281.

[5]Richman P S，Baram D，Varela M，et al.Sedation during mechanical ventilation:a trial of benzodiazepine and opiate incombination[J].Crit Care Med，2006，34(5):1395-1401.