氯霉素眼用溫敏原位凝膠的制備及其兔眼刺激性研究

郝吉福，李學(xué)桐，張翠玲，王建筑，郭豐廣，李菲（.泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，泰安市 7000；.山東泰安榮軍醫(yī)院，泰安市 7000）

局部給藥被認為是眼部給藥系統(tǒng)的首選途徑，臨床常見眼用制劑包括滴眼劑、眼膏劑、凝膠劑等，但眼用液體制劑存在眼部滯留時間短、半固體制劑給藥劑量不準確等缺點，為此，人們設(shè)計了基于高分子親水聚合物為基質(zhì)的原位凝膠系統(tǒng)用于眼部黏膜給藥以期改善現(xiàn)存問題[1]。

氯霉素用于治療由大腸桿菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌和其他敏感菌所致眼部感染，如沙眼、結(jié)膜炎、角膜炎、眼瞼緣炎等，滴眼劑為其臨床常用制劑。本文擬以氯霉素為模型藥物，將其設(shè)計成眼用溫敏原位凝膠，采用高效液相色譜（HPLC）法建立氯霉素含量測定方法，考察其體外藥物釋放特性及進行刺激性實驗，為眼部藥物傳遞提供新的給藥系統(tǒng)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HPLC儀，包括LC-10AD泵、SPD-10A檢測器、7225進樣器、C-R6A數(shù)據(jù)處理器（日本島津公司）；SHZ-88往復(fù)式水浴恒溫振蕩器（江蘇太倉市實驗設(shè)備廠）；KQ-500E型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

氯霉素原料藥（南京白敬宇制藥有限公司，批號：090721，含量：99.37%）；氯霉素標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：130555-200803，含量：99.5%）；泊洛沙姆407、泊洛沙姆188（上海協(xié)泰化工有限公司）；氯霉素滴眼液（山東魯抗辰欣制藥有限公司，批號：091205，規(guī)格：12.5 mg∶5 mL）；氯霉素眼用溫敏原位凝膠（泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥劑實驗室，批號：100323、100325、060326，規(guī)格：25 mg∶10 mL）；甲醇為色譜純，氯化鈉、苯扎溴銨均為藥用級，水為注射用水。

1.3 動物

家兔，2.0～2.6 kg，♀♂各半，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（魯）20080002。

2 方法與結(jié)果

2.1 氯霉素眼用溫敏原位凝膠的制備

參考臨床所用氯霉素滴眼劑的規(guī)格為0.25%（g·mL－1），擬制備氯霉素眼用溫敏原位凝膠的含量與之相同。取0.25 g氯霉素、0.9 g氯化鈉先溶于注射用水中，加入25 g泊洛沙姆407、4.19 g泊洛沙姆188，低溫（＜4℃）貯存24 h至泊洛沙姆完全溶解后，滴加5%的苯扎溴銨使其濃度為0.01%，加注射用水稀釋制成2.5 mg·mL－1的氯霉素眼用溫敏原位凝膠100 mL。

所制備凝膠為透明黏稠狀液體，pH為7.02，采用攪拌子法測定膠凝溫度為29.5℃，模擬淚液（每升模擬淚液（STF）包括：6.7 g氯化鈉、0.08 g二水氯化鈣和2 g碳酸氫鈉，用硼酸調(diào)節(jié)其pH約為7.4）稀釋后膠凝溫度為34.4℃。對溫敏原位凝膠的要求應(yīng)在室溫下為自由流動液體，體溫條件下轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍虘B(tài)凝膠，因而膠凝溫度是處方研究的主要內(nèi)容（關(guān)于處方篩選過程已另文發(fā)表）。本試驗所制備的溫敏原位凝膠符合眼部用藥的特點。

2.2 氯霉素含量測定

2.2.1 色譜條件。色譜柱：DiamonsilTMC18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水＝45 ∶55；檢測波長：275 nm；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min－1；進樣量：20 μL。取“2.2.3”項下3種溶液進樣分析，結(jié)果凝膠基質(zhì)對氯霉素測定無干擾，理論板數(shù)按氯霉素計大于3000，在此色譜條件下氯霉素的保留時間為7.1 min左右，色譜詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白凝膠；B.標準品；C.樣品；1.氯霉素Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank gel；B.standard；C.sample；1.chloramphenicol

2.2.2 標準曲線的制備。精密稱取氯霉素標準品10.0 mg，置于25 mL容量瓶中，用適量甲醇溶解后，再用模擬人工淚液稀釋定容，得400 mg·L－1貯備液，分別用流動相稀釋成質(zhì)量濃度分別為3.2、6.4、8、16、32 mg·L－1的系列標準溶液，進樣20 μL。采用外標法，以氯霉素色譜峰面積（A）為縱坐標，氯霉素的濃度（c）為橫坐標，進行線性回歸，得標準曲線方程A＝42832c+3234.7（r＝0.9999）。表明氯霉素檢測濃度線性范圍為3.2～32 mg·L－1。

2.2.3 溶液的制備。標準品貯備液的制備：精密稱取氯霉素標準品10 mg，用甲醇溶解定容到25 mL，稀釋成0.4 mg·mL－1的溶液即為標準品貯備液。供試品溶液的制備：精密量取氯霉素眼用溫敏原位凝膠0.1 mL，加3.9 mL流動相后離心（50000 r·min－1）15 min，取上清液2 mL置于10 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度。空白溶液的制備：取制備凝膠的各種輔料，按比例制成空白眼用溫敏原位凝膠；按供試品溶液的制備方法制備成不含主藥的溶液，即得。

2.2.4 精密度和回收率試驗。在線性范圍內(nèi)制備低、中、高濃度的標準品溶液，于同日內(nèi)連續(xù)進樣5次及連續(xù)測定5 d，計算得日內(nèi)RSD分別為0.36%、0.35%、0.57%，日間RSD分別為1.12%、0.51%、1.06%。精密量取已知含量樣品（批號：100325）適量，共3份，分別加入80%、100%、120%標準品溶液，按“2.2.3”項下供試品溶液的制備方法制成溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣，測定含量，結(jié)果回收率分別為97.87%、98.94%、100.75%，RSD分別為0.72%、0.54%、1.64%。表明該方法專屬性強，靈敏度、準確性和重復(fù)性好，結(jié)果可靠，適用于氯霉素含量測定。

2.3 凝膠溶蝕與體外藥物釋放行為考察

2.3.1 凝膠的溶蝕與體外釋藥行為考察。采用無膜溶出法[2，3]考察凝膠溶蝕特征。取氯霉素溫敏原位凝膠（約1～2 g）置于10 mL具塞刻度試管（15 mm×100 mm，已稱重）中，精密稱重，在（34±0.5）℃恒溫水浴振蕩器中放置10 min，待樣品形成凝膠，加入2.4 mL釋放介質(zhì)（模擬淚液，34℃），恒溫振蕩，頻率100 r·min－1，振幅20 mm。每20 min 取出全部釋放介質(zhì)，擦干試管表面，迅速稱重，再將該試管放入恒溫水浴振蕩器中，平衡10 min，補充同溫同體積新鮮釋放介質(zhì)，重復(fù)操作。相鄰時間點的質(zhì)量差為凝膠溶蝕量，以凝膠溶蝕量除以最初凝膠質(zhì)量得不同時間點的凝膠累積溶蝕量，記為Q凝膠。

于考察凝膠溶蝕行為的同時測定藥物的釋放，將溶蝕試驗得到的每次取出的溶液置于5 mL容量瓶中，放冷，以釋放介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，測定氯霉素的含量，以累積藥物釋放量Q藥物與時間作圖，得到藥物釋放曲線，詳見圖2。

圖2 氯霉素眼用溫敏原位凝膠溶蝕曲線Fig 2 Erosion curves of Chloramphenicol thermosensitive in-situ gel for ophthalmic use

2.3.2 凝膠的溶蝕與體外釋藥行為評價。采用數(shù)學(xué)處理方法對不同時間t與Q凝膠及Q藥物進行方程擬合，探討凝膠的釋藥機制。結(jié)果，凝膠溶蝕遵循零級動力學(xué)方程，其溶蝕曲線方程為：Q凝膠＝0.3104t－0.0177（r＝0.9952）；氯霉素體外Q藥物與時間t不同擬合方程見表1（表中UQ為Unrelease quantity，即未釋放藥物量）。

表1 藥物釋放擬合方程Tab 1 Fitted equation of drug release

從表1中可知，氯霉素體外釋藥符合Hixon-Crowell模型，即溶出量的立方根與時間成正比，采用peppas方程對其釋藥機制進行探討，lgQ＝0.785lgt+1.5033。從peppas方程的釋放系數(shù)n（0.45＜n＝0.785＜0.95），可知藥物從凝膠中的釋放為非Ficks擴散，受藥物擴散與凝膠溶蝕的雙重機制的影響。另將Q凝膠與Q藥物進行回歸分析，得Q藥物＝78.754Q凝膠+8.7019（r＝0.9969），表明凝膠溶蝕與藥物釋放呈良好的線性關(guān)系。

2.4 眼部刺激性實驗[4，5]

為考察氯霉素眼用溫敏原位凝膠連續(xù)給藥對眼睛刺激情況，以家兔為對象，給藥前先觀察并記錄每只家兔角膜、虹膜及結(jié)膜情況，已有病變或炎癥者，剔除不用。取合格家兔6只，采用“同體自身對照法”進行實驗。實驗時，將家兔下眼瞼輕輕提起，將結(jié)膜囊拉成環(huán)狀，在家兔左眼結(jié)膜囊內(nèi)滴入凝膠0.1 mL，同時在家兔右眼滴入0.1 mL氯霉素滴眼液作為對照，每天給藥2次，連續(xù)7 d。給藥后使家兔眼睛被動閉合8～10 s，觀察每次給藥前、后眼部情況及停藥后連續(xù)7 d眼的局部反應(yīng)情況（6、24、48、72、96、120、144、168 h，8～14 d），按Draize試驗評分標準對角膜、虹膜及結(jié)膜分別進行評價，算出平均分值，并與同一家兔對照眼進行比較。然后按表2的評價標準，判斷凝膠對眼的刺激性。當角膜、虹膜及結(jié)膜的刺激強度不一致時，應(yīng)分別作出評價。眼刺激性評價標準見表2。

表2 眼刺激性評價標準Tab 2 Standard evaluation of eye irritation

計算各組不同時間的角膜、虹膜及結(jié)膜的平均分值，將3種平均分值相加，即得眼刺激反應(yīng)的綜合平均分值。根據(jù)評定標準判定制劑對兔眼的刺激性，結(jié)果見表3。

表3 氯霉素眼用溫敏原位凝膠連續(xù)給藥對家兔眼刺激性實驗結(jié)果（n＝6）Tab 3 Results of eye irritation test by successive administration of Chloramphenicol thermosensitive in-situ gel for ophthalmic use（n＝6）

在觀察期內(nèi)發(fā)現(xiàn)，凝膠給藥后角膜在實驗初期有混濁現(xiàn)象，實驗中后期混濁消失；虹膜無異常現(xiàn)象；結(jié)膜無水腫、無分泌物，在實驗初期有輕微充血現(xiàn)象，實驗中后期該異?，F(xiàn)象消失?？赡芘c實驗過程中氯霉素溫敏凝膠從冰箱中取出后直接用于實驗，較低溫度造成對家兔眼睛的刺激性有關(guān)。但經(jīng)過一段時間能恢復(fù)正常，眼角膜、虹膜、結(jié)膜刺激綜合評分小于3，表明氯霉素眼用溫敏凝膠連續(xù)給藥對兔眼無刺激性。

3 討論

原位凝膠[6]（In-situ gel）是指以溶液狀態(tài)給藥后立即在用藥部位發(fā)生相轉(zhuǎn)變，形成的非化學(xué)交聯(lián)的半固體制劑。形成機制利用了高分子材料對外界環(huán)境的響應(yīng)，使聚合物在生理條件下發(fā)生分散狀態(tài)或構(gòu)象的可逆變化，實現(xiàn)由溶液向凝膠的轉(zhuǎn)化過程。原位凝膠獨特的溶液-凝膠轉(zhuǎn)變性質(zhì)使其具有制備簡單、使用方便、與用藥部位尤其是黏膜組織親和力強、滯留時間長等優(yōu)點。因此，原位凝膠能以液體狀態(tài)自由加載各種性質(zhì)的藥物，是眼用制劑的優(yōu)良載體[7]。

原位凝膠給藥后在用藥部位對外界刺激發(fā)生響應(yīng)形成凝膠狀，藥物在眼部被相對固定，局部吸收較多，可防止某些極苦或強刺激性的藥物不會大量快速通過鼻淚管流入口鼻，增加患者依從性。其在一定程度上還減少了滴眼劑的用量，減少了不良反應(yīng)的發(fā)生，因此眼用溫敏原位凝膠適合眼部給藥。

國外研究[8]表明，泊洛沙姆對組織無明顯損傷，刺激性小，生物相容性好，是常用的溫度敏感性材料，其中泊洛沙姆188還是目前使用在靜脈乳劑中唯一的合成乳化劑，因此安全性好。

研究凝膠類藥物傳遞系統(tǒng)的釋放行為，通常可采用擴散池法或透析法。筆者曾經(jīng)采用家兔離體角膜滲透實驗進行凝膠體外釋放行為研究，但因為角膜上部給藥時溫度不宜控制，在實驗過程中凝膠有時不發(fā)生相變，給實驗結(jié)果帶來較大誤差。而后采用無膜溶出模型可更好地模擬眼內(nèi)淚液不斷分泌溶蝕凝膠的情況，且對于不同濃度凝膠的考察其前提是應(yīng)保持一定的振蕩頻率，以保證凝膠溶蝕面積的恒定。在以后工作中尚需進一步考察眼用溫敏原位凝膠的生物利用度。

[1]李馨儒，雷耀龍，沈傳勇，等.阿昔洛韋眼用pH敏感原位凝膠劑的制備和評價[J].中國新藥雜志，2009，18（24）：2360.

[2]Bhardwaj R，Blanchard J.Controlled release delivery system for the α-MSH analog Melanotan-Ⅰ using poloxamer 407[J].J Pharm Sci，1996，85（9）：915.

[3]鞠鳳閣，朱照靜，王麗娟，等.雙氯芬酸鈉眼用溫敏凝膠的處方優(yōu)化及體外釋放[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29（7）：541.

[4]趙寧民，張 凱，王豫輝.鹽酸司帕沙星原位膠化滴眼劑的制備及質(zhì)量控制[J].中國藥房，2008，19（10）：772.

[5]宋成君，王 瑩，王春艷，等.黃芩溫度敏感凝膠劑的研究[J].中國中藥雜志，2008，33（6）：628.

[6]魏 剛，徐 暉，鄭俊民.原位凝膠的形成機制及在藥物控制釋放領(lǐng)域的應(yīng)用[J].中國藥學(xué)雜志，2003，38（8）：564.

[7]陳兩綿，王錦玉，仝 燕，等.黏膜給藥原位凝膠的研究進展[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2008，14（8）：76.

[8]El-Kamel AH.In vitro and in vivo evaluation of Pluronic F127-based ocular delivery system for timolol maleate[J].Int J Pharm，2002，241（1）：47.