IL-1α對豬小梁細(xì)胞ELAM-1、MAPK通路蛋白表達(dá)的影響△

朱玉廣 王 杰 吉艷艷 朱 艷 鐘瑩瑩 杜孝楠 張 榮

青光眼小梁細(xì)胞和Schlemm管內(nèi)皮細(xì)胞能特異性表達(dá)內(nèi)皮白細(xì)胞黏附因子-1(endothelial leukocyte adhesion molecule-1，ELAM-1)［1］。在正常人眼小梁內(nèi)皮細(xì)胞中，外源性白細(xì)胞介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)可以刺激小梁細(xì)胞內(nèi)源性IL-1α及ELAM-1的表達(dá)，活化核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)，模擬青光眼IL-1的持續(xù)表達(dá)狀態(tài)［2］。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，ELAM-1介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要是通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路進(jìn)行的，ELAM-1作為跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體，活化MAPK級聯(lián)效應(yīng)，形成Ras/Raf-1/磷酸化MEK復(fù)合物，引起c-fos表達(dá)上調(diào)［3］。我們推測，ELAM-1對小梁細(xì)胞的作用可能同時伴隨MAPK信號通道的改變。為了驗證此推測，我們設(shè)計此課題，以探討青光眼的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 取新殺成年豬眼球，無菌條件下低溫冰盒運回實驗室，進(jìn)行原代培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(GIBCO公司);兔抗人纖維連接蛋白(FN)多克隆抗體、兔抗人層粘連蛋白(LN)多克隆抗體、豬重組IL-1α(R＆D公司)、兔抗鼠多克隆免疫球蛋白G(Santa Cruz公司);磷酸化的ERK1/2抗體及磷酸化的P38抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.3 小梁細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)豬眼小梁細(xì)胞，免疫組織化學(xué)染色(SP法)對傳第3代的小梁細(xì)胞分別進(jìn)行FN、LN染色鑒定［4］。

1.4 細(xì)胞分組 待爬片的小梁細(xì)胞接近融合時，將細(xì)胞爬片血清饑餓培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞分成2組:對照組和IL-1α組。對照組加入無血清培養(yǎng)基，IL-1α組加入10 mg·L-1IL-1α，放入含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)30 min。

1.5 SP法測定 豬眼小梁細(xì)胞ELAM-1表達(dá)。每組隨機(jī)選取5個視野，計算每個視野陽性細(xì)胞均數(shù)。

1.6 Western blotting測定 應(yīng)用 Western blotting技術(shù)，以β-actin作為內(nèi)參照，比較IL-1α對豬眼小梁細(xì)胞磷酸化的ERK1/2、JNK和P38蛋白表達(dá)的影響。采用Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，用目的蛋白條帶的平均光強(qiáng)度值與β-actin條帶的平均光強(qiáng)度值的比值表示該蛋白表達(dá)的相對強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 小梁細(xì)胞的鑒定 豬眼傳第3代的小梁細(xì)胞免疫組織化學(xué)FN、LN染色陽性，可鑒定為小梁細(xì)胞。

2.2 豬眼小梁細(xì)胞ELAM-1的表達(dá) 正常豬眼小梁細(xì)胞不表達(dá)ELAM-1，經(jīng)IL-1α刺激后小梁細(xì)胞ELAM-1的表達(dá)顯著增加(圖1)。同對照組相比差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 豬眼小梁細(xì)胞磷酸化的ERK1/2、JNK和P38的表達(dá) 檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)IL-1α作用的豬眼小梁細(xì)胞，磷酸化的ERK1/2、JNK和P38的表達(dá)明顯增加，其中IL-1α對JNK通路的影響最大(P＜0.05，圖2)。

3 討論

青光眼小梁細(xì)胞和Schlemm管內(nèi)皮細(xì)胞能特異性表達(dá)ELAM-1［1］，這種表達(dá)與青光眼類型、病變嚴(yán)重程度、青光眼治療史無關(guān)。在培養(yǎng)的小梁細(xì)胞系中仍保留此種性狀。ELAM-1是目前唯一被發(fā)現(xiàn)的青光眼房水外流通道細(xì)胞(包括小梁細(xì)胞和Schlemm管內(nèi)壁的內(nèi)皮細(xì)胞)的分子標(biāo)志。但目前ELAM-1在青光眼發(fā)病中的作用未明，小梁網(wǎng)的結(jié)構(gòu)和功能與微血管內(nèi)皮層類似，ELAM-1在兩者中可能具有相同的調(diào)節(jié)機(jī)制［5-6］，有研究表明青光眼的病理機(jī)制和病理改變與多種血管性疾病相同［1］。對ELAM-1的研究必將加深對青光眼發(fā)病機(jī)制的了解。

Figure 1 Effect of IL-1α on expression of ELAM-1 in pig trabecular meshwork cells IL-1α對豬眼小梁細(xì)胞ELAM-1表達(dá)的影響

Figure 2 Effect of IL-1α on expression of ERK1/2，JNK and p38 protein in pig trabecular meshwork cells IL-1α對豬眼小梁細(xì)胞磷酸化的ERK1/2、JNK和P38表達(dá)的影響

小梁網(wǎng)的結(jié)構(gòu)和功能與微血管內(nèi)皮層的類似［5］。在血管疾病中ELAM-1的表達(dá)與液體壓力梯度和氧化應(yīng)激有關(guān)［6］，因此我們有理由推測青光眼房水外流通道特異性表達(dá)ELAM-1可能與青光眼發(fā)病的主要危險因素眼壓升高和氧化應(yīng)激有關(guān)，并且可能與血管疾病中ELAM-1的表達(dá)具有相同的調(diào)節(jié)機(jī)制。

研究顯示，ELAM-1的表達(dá)與IL-1/NF-κB自反饋途徑有關(guān)［1］。青光眼小梁細(xì)胞能持續(xù)表達(dá)IL-1α，且這種內(nèi)源性的IL-1α在ELAM-1的自反饋調(diào)控中起主要作用。在正常人眼小梁內(nèi)皮細(xì)胞中，外源性IL-1α可以刺激內(nèi)源性IL-1α及ELAM-1的mRNA和蛋白表達(dá)，活化NF-κB，模擬青光眼IL-1的持續(xù)表達(dá)狀態(tài)［2］。

在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，ELAM-1介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過MAPK途徑實現(xiàn)的，ELAM-1作為跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體，活化 MAPK級聯(lián)，形成 Ras/Raf-1/磷酸化MEK復(fù)合物，引起c-fos基因表達(dá)上調(diào)［3］。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在小梁細(xì)胞也存在MAPK途徑［7］。我們可以推測，IL-1α對小梁細(xì)胞的作用可能同時伴隨了MAPK途徑的改變。MAPK通路主要包括:(1)絲裂原活化蛋白激酶信號通路(ERK1/2);(2)c-Jun N端激酶信號通路(JNK);(3)p38 MAPK 信號通路［8］。

小梁網(wǎng)的結(jié)構(gòu)和功能與微血管內(nèi)皮層類似［5］。我們推測，IL-1α對小梁細(xì)胞的作用可能同時伴隨了MAPK途徑的改變。

我們的結(jié)果顯示，正常豬眼小梁細(xì)胞不表達(dá)ELAM-1，經(jīng)IL-1α刺激后小梁細(xì)胞ELAM-1的表達(dá)顯著增加。經(jīng)IL-1α作用的豬眼小梁細(xì)胞，磷酸化的ERK1/2、JNK和P38的表達(dá)顯著增加，其中JNK通路的表達(dá)改變最明顯。外源性IL-1α作用于豬眼小梁細(xì)胞后，MAPK通路所包括的ERK、JNK和p38通路均發(fā)生活化，其中對JNK通路的影響最大。

Wang 等［9］認(rèn)為小梁細(xì)胞 IL-1/NF-κB/ELAM-1的表達(dá)可能是青光眼自我代償機(jī)制之一。我們認(rèn)為，IL-1/ELAM-1/MAPK蛋白的表達(dá)也可能是青光眼自我代償機(jī)制。當(dāng)房水外流通路組織受到外界刺激如眼壓升高時，小梁細(xì)胞可通過MAPK信號通道的活化以代償應(yīng)激反應(yīng)，通過MAPK途徑影響細(xì)胞的增殖和細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附性，改變細(xì)胞形態(tài)［10］，提高房水外流通暢性來影響眼壓。

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10周 崎，趙家良，劉玉琴.內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞粘附分子-1對豬眼小梁細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞骨架的作用［J］.中華眼科雜志，2004，40(9):614-619.