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    西寧市售動物性食品中腸出血型大腸桿菌O157∶H7的檢測

    2011-05-18 08:40:56李增魁種偉雄
    中國動物檢疫 2011年7期
    關(guān)鍵詞:脫羧酶山梨醇產(chǎn)氣

    李增魁,馬 蘭,種偉雄

    (青海大學農(nóng)牧學院,青海 西寧 810016)

    食源性病源微生物品安全的重要因素,其中大腸桿菌O157:H7是腸出血性大腸埃希氏菌(enterohemorrhagic escherichia coli,EHEC) 的一個主要菌型,是近年來新發(fā)現(xiàn)的嚴重危害人類生命健康的一種腸道病原性微生物,也是近年來在食品衛(wèi)生及腸道感染領(lǐng)域中最重要的研究進展之一。腸出血性大腸桿菌O157:H7主要通過食物傳播,牛、羊、豬和雞等家畜家禽是其主要貯存宿主。感染此菌可使人患腹瀉、出血性結(jié)腸炎(HC),也可引發(fā)溶血性尿毒綜合癥(HUS)及血檢形成性血小板減少性紫癜(TTP)等嚴重并發(fā)癥等,甚至死亡。

    E.coli O157:H7于1983年被首次分離[1],屬于腸桿菌科埃希氏菌屬。革蘭氏染色陰性,無芽孢,有鞭毛,動力試驗呈陽性。1996年在日本發(fā)生的EHEC O157:H7的暴發(fā)流行,引起出血性腹瀉,先后波及30多個都、府、縣,感染近萬人,并造成12人死亡,引起了全世界的關(guān)注[2]。以前O157:H7大腸桿菌僅為世界發(fā)達國家引起食物中毒的暴發(fā)流行,與畜食類制品有關(guān)[3]。近來國內(nèi)本菌流行尚有抬頭之勢[4-6]。據(jù)報道市場零售肉類污染率,牛肉為3.7%,豬肉1.5%,羊肉2.0%,禽肉1.5%,認為這都與屠宰過程中污染有關(guān)[7]。2010年,我們按傳統(tǒng)方法對西寧部分市場的動物性食品進行了大腸桿菌O157:H7選擇培養(yǎng),現(xiàn)報告如下。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 試樣來源

    羊肉及牛肉各20份均采自西寧市樂家灣屠宰場,豬肉、雞腸、雞蛋各20份、鹵肉10份采自莫家街、小橋、商業(yè)巷等市場。

    1.1.2 菌株

    大腸桿菌Escherichia coli O157:H7菌株86-24購于廣東省微生物菌種保藏中心;試驗菌株均從試樣中分離。

    1.1.3 實驗試劑

    頭孢克肟(上海海虹實業(yè))、亞碲酸鉀(華北化學試劑開發(fā)中心)、山梨醇(北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司)、新生霉素(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)、月桂基硫酸鈉(華北地區(qū)特種化學試劑開發(fā)中心)、三號膽鹽(北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司)。

    1.1.4 實驗儀器

    電熱恒溫培養(yǎng)箱(蘇州宏拓電子有限公司)、移液槍(上??迫A實驗系統(tǒng)有限公司)、暗箱式紫外線透射分析儀 MODEL Fs-312(上海復(fù)生生物工程研究所)、回旋式氣浴恒溫振蕩器SHZ-82(金壇市科技儀器有限公司)。

    1.1.5 培養(yǎng)基

    1.1.5.1 蛋白胨水配方 蛋白胨1 g,氯化鈉0.5 g,水加至100mL pH調(diào)至7.8;胰蛋白胨20g,3號膽鹽1.5 g,乳糖 5 g,磷酸二氫鉀 1.5 g,磷酸氫二鉀 4 g,氯化鈉5 g,蒸餾水1000mL。

    以上成分混合、加熱、融化,調(diào)節(jié)pH6.9±0.2,高壓滅菌,冷至50℃左右,加新生霉素,新生霉素終濃度為 20 μ g/mL,傾倒平板即可。

    1.1.5.2 改良山梨醇麥康凱瓊脂(TC-SMAC)培養(yǎng)基配方 蛋白胨7 g;眎蛋白胨3 g;豬膽鹽5 g;山梨醇10g;氯化鈉5 g;瓊脂18 g;0.5%中性紅水溶液5mL;0.01%結(jié)晶紫水溶液10mL;亞碲酸鉀2.5 mg;頭孢克肟0.05 g;蒸餾水1000mL,pH7.2。

    除山梨醇、指示劑、抑菌劑外,115℃滅菌20min至50℃,加入山梨醇,滅菌的0.01%結(jié)晶紫水溶液、0.5%中性紅水溶液,過濾除菌的1%亞碲酸鉀250μL和50g/L頭孢克肟1mL。

    1.1.5.3 MUG-LST肉湯培養(yǎng)基配方 胰蛋白胨20g,氯化鈉5 g,乳糖5 g,磷酸二氫鉀2.75 g,磷酸氫二鉀2.75 g,月桂基硫酸鈉0.1 g,蒸餾水1000mL。

    分裝到有倒立發(fā)酵管的試管中,每管10mL,pH6.8±0.2,121℃滅菌15min。加MUG終濃度0.1g/L。

    1.1.5.4 NFA培養(yǎng)基配方 酪蛋白胨20g,肉浸膏2 g,酵母浸膏1 g,山梨醇10g,枸櫞酸鐵銨0.5 g,硫代硫酸鈉2 g,去氧膽酸鈉1.12 g,溴酚藍0.025 g,瓊脂 13 g,蒸餾水 1000mL。pH7.4,121 ℃滅菌 15min。

    1.1.5.5 營養(yǎng)平板和肉湯 按常規(guī)配方配制。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 E.coli O157:H7的顯微形態(tài)

    通過革蘭氏染色和鞭毛染色來觀察其顯微形態(tài),確定其為革蘭氏陰性菌并有鞭毛存在。

    1.2.2 E.coli O157∶H7的增菌培養(yǎng)

    1.2.2.1 無菌稱取25 g試樣于225mL mEC增菌液,(41±1)℃培養(yǎng) 18~24 h。

    1.2.2.2 接種于TC-SMAC上,(36±1)℃培養(yǎng)18~24 h,觀察菌落形態(tài),若菌落扁平、透明或半透明,邊緣光滑、呈淡褐色中心直徑越2mm,視為可疑菌落。

    1.2.2.3 挑取5~10個可疑菌落接種于MUG-LST,(36±1)℃培養(yǎng)18~24 h。觀察MUG-LST培養(yǎng)結(jié)果,若出現(xiàn)產(chǎn)氣且無熒光者判為MUG陰性培養(yǎng)物。

    1.2.2.4 可疑菌接至NFA培養(yǎng)基(36±1)℃培養(yǎng)18~24 h,觀察菌落形態(tài)。

    1.2.2.5 同時轉(zhuǎn)接普通營養(yǎng)瓊脂(36±1)℃培養(yǎng)18~24 h。

    1.2.3 E.coli O157:H7的生理生化特性 根據(jù)E.coli O157:H7具有大腸桿菌的通性,如發(fā)酵葡萄糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣等,同時還具有自身的特性,如不發(fā)酵山梨醇或遲緩發(fā)酵山梨醇設(shè)計了E.coli O157:H7的生理生化實驗,其中檢測項目包括葡萄糖、乳糖、木糖、棉子糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、甘露醇的發(fā)酵實驗、檸檬酸鹽利用實驗、過氧化氫酶實驗、苯丙氨酸脫氨實驗、賴氨酸與精氨酸脫羧酶實驗、硝酸鹽還原實驗以及精氨酸雙水解酶實驗。

    2 結(jié)果

    2.1 檢出率 對西寧市售的動物性食品羊肉20份、牛肉20份、豬肉20份、雞肉20份、牛奶20份、鹵肉10份共110份進行了檢驗,從羊肉中檢出大腸桿菌O157:H71株,占0.9%。

    表1 6類食品中EHEC O157:H7的檢出情況

    2.2 分離菌株生物學性狀

    2.2.1 形態(tài) 分離菌株均為革蘭陰性無芽胞桿菌,在營養(yǎng)肉湯和EC肉湯中生長良好,在TC-SMAC平板上37℃培養(yǎng)24 h后的菌落形態(tài)呈菌落扁平、透明或半透明,邊緣光滑,呈淡褐色中心;普通大腸桿菌呈粉紅色菌落。純培養(yǎng)物接種NFA培養(yǎng)基平板,37℃培養(yǎng)24 h觀察,20min在暗室中長波紫外燈下,為綠色菌落。普通大腸桿菌呈黃色菌落,且產(chǎn)生有很強的電藍色熒光。在MUG-LST肉湯培養(yǎng)基中,產(chǎn)氣,無熒光。

    2.2.2 生化反應(yīng)特性 均符合大腸桿菌特征,能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,系統(tǒng)生化見表2。

    由表2可見:分離到的菌株發(fā)酵葡萄糖、乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,木糖、棉子糖、甘露醇呈陽性;遲緩發(fā)酵山梨醇;賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶實驗、過氧化氫酶實驗呈陽性,硝酸鹽還原實驗、側(cè)金盞花醇、苯丙氨酸脫氨實驗、硫化氫均為陰性,這些結(jié)果都符合典型的E.coli O157:H7的生理生化特性[8],并可與腸桿菌科絕大部分菌區(qū)分[9];致賀氏菌屬、耶爾森氏菌屬和愛德華氏菌屬不發(fā)酵葡萄糖;檸檬酸細菌屬不與賴氨酸反應(yīng);沙雷鐵氏菌屬、克雷伯氏菌屬和變形菌屬不與精氨酸反應(yīng)。以上這些菌屬都可通過上述生理生化反應(yīng)來加以區(qū)分(不包括變異株)。

    表2 試驗菌株與參考菌株的生化特性比較

    3 分析與討論

    3.1 新病原性微生物和重新抬頭的病原微生物是當前醫(yī)學界面臨的一個新的課題,對人類健康構(gòu)成重大威脅。腸出血性大腸桿菌O157:H7就是其中之一[10]。以前E.coli O157:H7僅為世界發(fā)達國家引起食物中毒的暴發(fā)流行[3],近年來國內(nèi)對本菌多有檢測[4-6]。目前有人從蔬菜及熟肉制品中分離出O157:H7腸出血性大腸桿菌,從而證實了EHEC在我國食品中存在感染[11]。本次調(diào)查從市售羊肉中分離到了疑似E.coli O157:H7,檢出率為0.9%,豬肉、牛肉、雞蛋和鹵肉中未檢出。這提示我市動物性食品中存在食源性致病菌污染,應(yīng)予以重視。也證明了綿羊確是O157:H7貯存宿主。豬肉、牛肉、雞蛋、熟肉雖未檢出致病菌,可能與季節(jié)氣溫較低或取樣品數(shù)量等有關(guān),加強食品衛(wèi)生管理,控制可能出現(xiàn)的傳染源,切斷傳播途徑,提高群眾防范意識,是杜絕O157:H7食物中毒暴發(fā)流行的關(guān)鍵所在。

    3.2 本次分離的菌株經(jīng)鑒定,菌體形態(tài)典型,培養(yǎng)及生化特性均符合于大腸桿菌的定義,并具有不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵山梨醇的特性,同時在O157:H7的選擇性培養(yǎng)基TC-SMAC平皿上生長出典型的扁平、透明或半透明,邊緣光滑,呈淡褐色中心的菌落。NFA培養(yǎng)基平板上在暗室中長波紫外燈下,為綠色菌落。March等[12]用TC-SMAC平皿對O157:H7進行檢測,其檢測的靈敏度為100%,但是特異性只有85%,準確率只有86%。為了提高檢測效率,在SMAC培養(yǎng)基中加入鼠李糖(rharose)和頭孢克肟(cefixime)改進,成為CT-SMAC培養(yǎng)基[13],提高了分離的準確性;FARMER等[14]利用O157:H7有H7抗原,而其他大腸桿菌只有10%的具有H7抗原的特性,設(shè)計了H7抗血清—山梨醇發(fā)酵培養(yǎng)基,其假陽性率小于1%。但是由于O157:H7與其他一些病原菌有共同的特性,用單一的方法檢測,無論如何都達不到滿意的效果,對此我國[15]以及FDA[16]在制定檢測標準時加了生理生化特性驗證和血清(免疫)學驗證,以保證檢測的準確性。

    3.3 本次分離的菌株在MUG-LST肉湯培養(yǎng)基中,產(chǎn)氣,無熒光。李景學等[17]認為96%的大腸桿菌具有葡萄糖醛酸酶,故水解4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG),產(chǎn)生熒光,而O157:H7則為陰性反應(yīng)。

    3.4 Krishman等[18]分別報道的24株和37株O157:H7的生化結(jié)果,其山梨醇均為陰性,而賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、棉子糖和衛(wèi)矛醇均為陽性,故以這5種生化特性作為O157:H7與普通大腸桿菌的鑒別要點。但葉青[19]分離的O157:H7中2株為山梨醇陽性、棉子糖陽性,1株衛(wèi)矛醇陽性。故說明有的菌株發(fā)生變異,其部分生化反應(yīng)也不完全一樣。Krishman證實,山梨醇、MUG陰性、棉子糖陽性僅發(fā)生于大腸桿菌O157:H7血清型,對檢測該菌非常有效。本次分離到的菌株發(fā)酵葡萄糖、乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,木糖、棉子糖呈陽性;遲緩發(fā)酵山梨醇;賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶實驗、過氧化氫酶實驗呈陽性,硝酸鹽還原實驗、側(cè)金盞花醇、苯丙氨酸脫氨實驗、硫化氫均為陰性。此結(jié)果與國內(nèi)學者的結(jié)果一致。

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