山羊干酪性淋巴結(jié)炎病原的分離和鑒定

韋志鋒 ，李常挺 ，陶 立 ，李 軍 ，林忠捷 ，陳澤祥 ，楊 威

（1.廣西獸醫(yī)研究所，廣西 南寧 530001；2.廣西隆安縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 隆安 532700；3.廣西隆安縣都結(jié)鄉(xiāng)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站，廣西 隆安 532712）

2010年9月我所接到一起以皮下淺表淋巴結(jié)腫大，后期腫大淋巴結(jié)呈膿性干酪樣壞死的病例報(bào)告。該病例雖然病羊全身癥狀不明顯，死亡率低，但發(fā)病率較高，很難徹底根除。由于病羊經(jīng)常不斷，生長緩慢、消瘦，給農(nóng)戶造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。為了查明病因，我們進(jìn)行了流行病學(xué)的跟蹤調(diào)查，無菌采集干酪樣膿汁病料作實(shí)驗(yàn)室病原的分離鑒定，經(jīng)對(duì)病原分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、動(dòng)物致病性試驗(yàn)和PCR檢測(cè)鑒定該病病原為偽結(jié)核棒狀桿菌，并根據(jù)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果對(duì)病羊進(jìn)行治療，提出了綜合防治措施。

1 流行病學(xué)和臨床癥狀

該養(yǎng)殖場(chǎng)位于隆安縣都結(jié)鄉(xiāng)，現(xiàn)有存欄山羊120多只，以飼養(yǎng)本地黑山羊和隆林山羊的雜交后代為主，也引進(jìn)有少量波爾和努比亞等外來品種。據(jù)畜主反映，半年多前開始發(fā)病，發(fā)病主要集中在春夏季，其他季節(jié)也陸續(xù)有發(fā)生。以母羊、大羊發(fā)病為主，外來品種的山羊發(fā)病較多，小羊（約2～3月齡）也有零星發(fā)生。累計(jì)發(fā)病多達(dá)40余只，發(fā)病率約為30%左右?，F(xiàn)場(chǎng)觀察，主要臨床癥狀是:在耳朵兩側(cè)、頜下、頰部、肩前和乳房附近等淋巴結(jié)密集區(qū)域有鴿蛋至乒乓球大小的圓形或橢圓形的腫脹，起初手感較硬，在1個(gè)月左右、快則10～20天開始化膿，觸之有波動(dòng)感；繼而膿腫破潰，流出黃白色或淡黃綠色濃稠如牙膏狀的膿汁，經(jīng)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)溫，病羊體溫不高，在面部有膿腫時(shí)同側(cè)出現(xiàn)輕微流涕或稍有眼屎現(xiàn)象；無拉稀、咳嗽；膿塊開裂時(shí)采食略有減少；病羊有輕微消瘦。

2 實(shí)驗(yàn)室檢查

2.1 材料

2.1.1 病料 來自山羊皮下淺表淋巴結(jié)膿腫膿汁。

2.1.2 試劑儀器和動(dòng)物 馬丁湯、10%犢牛血清的馬丁湯、麥康凱、馬丁瓊脂和兔血瓊脂平板均為廣西獸醫(yī)研究所細(xì)菌研究室配制，微量生化管和各種藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司。PCR Taq Mix、DNA Marker 3購自廣東東盛生物科技有限公司。PCR儀購自日本TaKaRa公司；凝膠成像系統(tǒng)購自美國Alpha Inotech公司。試驗(yàn)用小白鼠購自廣西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2.2 方法

2.2.1 膿腫膿汁涂片，革蘭氏染色后于光學(xué)顯微鏡下鏡檢。

2.2.2 病原的分離培養(yǎng) 將膿腫膿汁分別接種馬丁湯、10%犢牛血清的馬丁湯、麥康凱、馬丁瓊脂和鮮血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落的形態(tài)。并取單個(gè)菌落染色鏡檢和作純化培養(yǎng)。

2.2.3 病原生化特性試驗(yàn) 純化菌接種各種微量生化管，經(jīng)37℃24～48 h培養(yǎng)觀察結(jié)果。

2.2.4 致病性試驗(yàn) 取純化菌的24 h 10%犢牛血清馬丁湯培養(yǎng)液進(jìn)行了小白鼠致病性試驗(yàn)，試驗(yàn)組分皮下和腹腔接種2組，每組4只小鼠，每只均接種0.3mL菌懸液，對(duì)照組3只小白鼠腹腔接種等量的10%犢牛血清馬丁湯作對(duì)照，觀察結(jié)果。

2.2.5 PCR鑒定 用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒抽提病原菌純培養(yǎng)物的DNA，按Morenol等（2002）方法[1]進(jìn)行16S rRNA基因的PCR鑒定。

2.2.6 藥敏試驗(yàn) 將純化的病原菌先在10%犢牛血清馬丁湯中培養(yǎng)18～24小時(shí)，取此時(shí)的菌懸液0.2mL均勻涂布在10%犢牛血清馬丁瓊脂平板，涂布好的每個(gè)瓊脂平板靜置片刻，再將藥敏試紙片放置在平板劃定的區(qū)域，37℃倒置培養(yǎng)24 h后，測(cè)量抑菌圈（含紙片）的大小，每種藥物作3次重復(fù)取平均值為抑菌圈直徑。判斷標(biāo)準(zhǔn):抑菌圈直徑6mm以下為不敏感，7～9mm為低敏，10～15mm為中敏，16mm以上為高敏。

3 結(jié)果

3.1 膿汁涂片染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)有少量革蘭氏陽性的球桿菌，無莢膜和芽胞，多呈散在或成叢狀排列，抗酸染色陰性。

3.2 病原生長特性和形態(tài)觀察 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離菌在馬丁湯和馬丁瓊脂平板上生長緩慢，48 h后才開始見菌生長，在麥康凱瓊脂上不生長，但在鮮血瓊脂或犢牛血清瓊脂上生長良好，接種24 h出現(xiàn)針尖大小的菌落，48 h后見有直徑在1mm大小，灰白色、不透明的菌落，菌落干燥、中央突起、邊緣不整齊，在鮮血瓊脂平板上有β型溶血環(huán)。菌落在培養(yǎng)基上附著不牢，鉑金耳挑出時(shí)易破碎或移動(dòng)。取單個(gè)菌落在含10%犢牛血清的馬丁湯中培養(yǎng)，24 h后血清肉湯明顯變混濁，48 h后管底出現(xiàn)絮狀沉淀，液面有白色的菌膜。單個(gè)菌落培養(yǎng)物染色鏡檢為多形態(tài)革蘭氏陽性的球桿菌。

3.3 病原生化試驗(yàn) 分離菌株經(jīng)純化分別接種各微量生化管，在37℃培養(yǎng)48 h后觀察，結(jié)果見表1。其生化特性與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[2]中的偽結(jié)核棒狀桿菌的生化特性相符合。

表1 分離細(xì)菌的生化特性試驗(yàn)結(jié)果

3.4 致病性試驗(yàn) 結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)皮下接種的小鼠均在3～4天全部死亡，剖解可見接種部位化膿，周邊皮下組織呈膠樣浸潤，肝臟表面有大頭針大小的化膿灶；腹腔接種的小鼠均在2～3天全部死亡，剖解見肝臟、脾臟有大小不等的膿腫。取肝臟、脾臟涂片鏡檢可見革蘭氏陽性的球桿菌，并從皮下膿汁、肝臟、脾臟中回收到接種菌。對(duì)照小鼠在試驗(yàn)期間均無異常表現(xiàn)。

3.5 病原的PCR鑒定 用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物對(duì)病原菌純培養(yǎng)物提取的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約1200 bp的目的片段（圖1）。將PCR產(chǎn)物送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank上登錄的偽結(jié)核棒狀桿菌（登錄號(hào)D38578和CP002097）的核苷酸序列同源性100%，測(cè)序結(jié)果表明病原菌純培養(yǎng)物為偽結(jié)核棒狀桿菌。

3.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 該菌對(duì)丁胺卡那、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、恩諾沙星、頭孢曲松鈉、林可霉素、紅霉素等高敏；對(duì)復(fù)方新諾明、卡拉霉素、利福平、四環(huán)素、鏈霉素等中敏；對(duì)氯霉素、慶大霉素低敏；對(duì)青霉素G、頭孢拉定不敏感。

4 小結(jié)和討論

4.1 根據(jù)山羊發(fā)病經(jīng)過，臨床癥狀、病理變化和病原經(jīng)培養(yǎng)特性、生化試驗(yàn)、致病性試驗(yàn)和PCR鑒定，確診本病為偽結(jié)核棒狀桿菌引起的山羊干酪性淋巴結(jié)炎，證實(shí)其病原為偽結(jié)核棒狀桿菌。2010年10月鄭敏等[3]首次報(bào)道了從廣西崇左市大新黑山羊病例中分離到偽結(jié)核棒狀桿菌，此次分離菌株的性狀與其基本一致，也與貴州、陜西等地分離的菌株一致[4-5]。

4.2 對(duì)全群羊逐只進(jìn)行體表檢查，隔離病羊。同時(shí)全面清掃羊欄，對(duì)羊舍、場(chǎng)地、用具等用消毒威1:300倍稀釋噴灑消毒，將羊糞清理并堆積自然發(fā)酵。根據(jù)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)病羊體表成熟膿腫用消毒好的刀片切開，擠出排干膿汁，后用滅菌生理鹽水徹底沖洗干凈，再用磺胺結(jié)晶粉涂于患處，并根據(jù)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果，肌注環(huán)丙沙星3天，未發(fā)病羊也可減半藥量肌注3天作為預(yù)防。經(jīng)上述處理后病情很快得到控制，未見新的病例發(fā)生。

4.3 山羊干酪性淋巴結(jié)炎（caseous lymphadenitis in goat）也稱山羊偽結(jié)核病，是由偽結(jié)核棒狀桿菌引起的一種人畜共患的慢性傳染病[6]。該病不僅引起以皮下淺表淋巴結(jié)腫大，后期呈膿性干酪樣壞死的病變，最嚴(yán)重的病例可在內(nèi)臟器官肺、肝、脾和子宮角發(fā)生大小不等的結(jié)節(jié)，內(nèi)含淡黃色干酪樣物質(zhì)。由于病灶結(jié)節(jié)有一層致密的纖維性肉芽組織包裹，治療藥物往往難以滲入其內(nèi)，此外，偽結(jié)核棒狀桿菌可寄生于細(xì)胞內(nèi)，也使得一些藥物難以發(fā)揮作用，因此被世界公認(rèn)為難以防治的傳染病之一[7-8]，國內(nèi)目前尚無有效的菌苗用于預(yù)防，因此消除該病重在預(yù)防，主要措施如下。一不從疫區(qū)引種，非要引種時(shí)一定要嚴(yán)格檢疫。二定期消毒羊場(chǎng)，搞好環(huán)境衛(wèi)生，特別對(duì)病羊膿汁污染的場(chǎng)所及飼草，應(yīng)進(jìn)行徹底的消毒和清除。及時(shí)清理羊糞并進(jìn)行生物發(fā)酵處理。三定期檢查羊群，發(fā)現(xiàn)體表淋巴結(jié)腫大、化膿者，應(yīng)隔離治療。四注意保護(hù)羊只皮膚免遭損傷，特別是打耳標(biāo)、打針或去勢(shì)手術(shù)等，注意器械的消毒和傷口的處理，防止被該菌感染。五由于鼠類是它們的保存宿主，而且可通過蚊和鼠蚤的叮咬而傳播，因此要加強(qiáng)羊場(chǎng)周邊的滅鼠和滅蚊。六要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，確保飼料質(zhì)量和飲水清潔衛(wèi)生。圈養(yǎng)山羊要注意補(bǔ)喂精料、多維和各種微量元素，保持營養(yǎng)平衡，增強(qiáng)羊的體質(zhì)和自身抗病能力。

[1]Morenol C，Romerol J，Espejo R T.Polymorphism in repeated 16S rRNA genes is a common property of type strains and environmental isolates of the genus Vibrio[J].Microbiology，2002，148:1233-1239.

[2]R.E.布坎南，N.E.吉本斯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].中國科學(xué)院微生物研究所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》翻譯組，譯.8版.北京:科學(xué)出版社，1984:382-389，833-844.

[3]鄭敏，胡杰，歐紹毅，等.廣西黑山羊偽結(jié)核棒狀桿菌的分離與鑒定[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，41（10）:1128-1130.

[4]王璇，潘淑惠，萬晴姣，等.貴州山羊偽結(jié)核棒狀桿菌的生化鑒定[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2006（5）:33.

[5]王韋華，張彥明，邢福珊，等.羊偽結(jié)核棒狀桿菌的分離鑒定及 ELISA 檢測(cè)方法建立[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，25（1）:34-36.

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[7]趙宏坤，范偉興，胡敬東，等.羊偽結(jié)核病研究進(jìn)展[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，22（3）:236-237.

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