麻雞源性糞腸球菌的分離及初步鑒定

李金平，陳 杰，莊青葉

（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266032）

糞腸球菌（Enterococcus faecalis）屬于鏈球菌科（Strep tococcaceae）腸球菌屬（Enterococcus），為兼性厭氧的革蘭陽性球菌，自然界和動物糞便中大量存在。其為機(jī)會感染菌，在人醫(yī)上已成為院內(nèi)感染的第二大病原，在動物領(lǐng)域，對其研究較少。烏魯木齊地區(qū)的麻雞發(fā)生了一種疾病，剖檢可見，肝腫大嚴(yán)重，邊緣有壞死，脾腫大，腎腫大嚴(yán)重，有腫瘤結(jié)節(jié)，腺胃厚硬，乳頭環(huán)狀出血，腸道水腫出血。試驗(yàn)從麻雞體內(nèi)分離到一株可疑菌，并進(jìn)行了初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病料來自烏魯木齊市北站周圍養(yǎng)殖場的麻雞；未知細(xì)菌平板培養(yǎng)物來自烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心。

1.2 糞腸球菌的分離

無菌取病死羊的腦、肝、腸系膜淋巴結(jié)、脾等組織，接種于鮮血瓊脂LB平板，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，觀察生長情況及菌落特征。取單個(gè)疑似菌落繼續(xù)在瓊脂培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，對純培養(yǎng)菌落進(jìn)行革蘭染色，鏡檢。

1.3 菌株16 S rDNA基因序列鑒定

參照參考文獻(xiàn)[1]設(shè)計(jì)細(xì)菌16 S rRNA基因片段PCR擴(kuò)增通用引物，序列為上游引物5'-ATAACAATTTCACACAGG-3'下游引物5'-AGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。按照TaKaRaminiBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0（TaKaRa Code:DV810A）提取純培養(yǎng)細(xì)菌的基因組，以純培養(yǎng)細(xì)菌染色體DNA為模板，擴(kuò)增其16 S rRNA基因片段。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4min；94 ℃變性 30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將上述擴(kuò)增的目的片段用DNA片段回收純化試劑盒回收（按試劑盒說明書操作），并與pGEM-T easy載體連接過夜；轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞；將轉(zhuǎn)化的受體菌涂布在預(yù)先用 100mmol/L IPTG 20μL、20 mg/mL X-gal 100μL涂布、Amp終濃度為10 μ g/mL的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取白色菌落接種于含Amp（10 μ g/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、170 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)8～12 h；提取質(zhì)粒，陽性質(zhì)粒送上海工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。將測得的16 S rRNA基因片段，與GenBank中發(fā)表的糞腸球菌16 S rRNA基因進(jìn)行基因序列同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株形態(tài)

菌株在血瓊脂培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)2 d后，菌落呈灰白色、不透明、表面光滑，直徑0.5～1mm。在光學(xué)顯微鏡下觀察，菌體為紅色，革蘭陽性球菌，呈單個(gè)、成對或短鏈狀排列。

2.2 分離菌株16 S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

從提取的基因組DNA模板中擴(kuò)增得到16 S rRNA基因片段。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳證明獲得了與預(yù)期片段大?。?00 bp）相符的、清晰的，單一條帶（圖 1）。

2.3 分離菌株16 S rRNA基因序列測序結(jié)果

將大小約為500 bp的16 S rRNA基因序列測序結(jié)果用Blast進(jìn)行序列比對，結(jié)果表明:分離株16 S rRNA基因與GenBank中發(fā)表的糞腸球菌的16 S rRNA基因序列同源性達(dá)到99.0%，確定分離菌株為糞腸球菌。

3 討論

糞腸球菌廣泛存在于土壤、植物、乳制品中，為人、犬、禽、豬、馬等動物胃腸道正常菌群之一。近年在臨床上由糞腸球菌引起的感染有逐年上升趨勢，已成為呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、傷口感染、院內(nèi)感染的常見菌，并對多種抗菌藥物耐藥[2-3]。國內(nèi)對該菌的研究主要集中在其致病性及防治方法上，而國外對其抗藥性在基因水平上進(jìn)行了大量的研究。目前，糞腸球菌在國內(nèi)外都已經(jīng)被批準(zhǔn)作為微生態(tài)制劑菌種使用。

糞腸球菌為人獸共患條件致病菌，應(yīng)引起實(shí)驗(yàn)動物從業(yè)人員的高度重視。開展腸球菌感染的研究，可能會使人們提高對腸球菌感染認(rèn)識的警惕性。糞腸球菌為機(jī)會感染菌，其感染的原因可能與麻雞的體質(zhì)、環(huán)境溫度、衛(wèi)生以及糞腸球菌的耐藥性等有關(guān)，具體原因有待于調(diào)查。動物品質(zhì)和環(huán)境因素是不可忽視的原因，應(yīng)加強(qiáng)對實(shí)驗(yàn)動物和環(huán)境設(shè)施的管理。

[1]趙貴明.食品微生物實(shí)驗(yàn)室工作指南[M].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2005.

[2]劉鳳強(qiáng)，姬生瑞.檢出160株腸球菌的分布及耐藥性分析[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2005，5（9）:1879.

[3]胡龍華，賈坤茹，陳東紅，等.臨床分離的腸球菌株耐藥性變遷分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2004，14（8）:944-946.